나노 우유 단백질-점액 복합체: 특성화 및 항암 효과 1부

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추상적인:항암천연 화합물의 활성은 최근 다학제적 연구를 끌어들였습니다. 이 연구에서는 Isabgol husk mucilage(IHM) 및 Ziziphus Spina Christi mucilage(NabM)와 우유 단백질(MP)의 복합화를 조사했습니다. 이러한 맥락에서, pH, Carr's index, 수용해도, 수분 흡수 지수를 포함하는 우유단백 점액복합체(MPMC)의 물리화학적 특성을 측정하고 유동 거동을 연구하였다. 또한 아미노산 프로파일, 단백질 소화율, 페놀 및플라보노이드MPMC의 함량을 조사하고 복합체의 미세 구조를 투과 전자 현미경을 사용하여 시각화했습니다. 그만큼항산화제및 두 개의 정상 세포주인 Bj-1 및 MCF{{ 3}}F는 중성 적색 흡수 검정을 사용하여 테스트되었습니다. 그 결과 MPMC가 DPPH, ABTS 및 HS 라디칼에 대한 소거 활성이 있음이 밝혀졌습니다. 또한 MPMC는 Type-Fenton 반응에서 산화 스트레스에 의해 유발되는 DNA 손상을 방지할 수 있습니다. Neutral red assay 결과 HEPG-2, MCF{6}} 모두 유의한 성장 억제를 나타냈지만 Bj-1 및 MCF-12F에 대해서는 유의한 세포독성 효과가 검출되지 않았습니다. RT-qPCR 결과는 pro-apoptosis 유전자 마커인 Caspase{11}}, p53, Bax의 상향조절에 의해 밝혀진 바와 같이 MPMC가 세포자살을 자극했음을 나타냅니다. 한편, 항세포자멸사 Bcl{14}} 유전자는 하향조절되었습니다. 그러나 MPMC를 처리한 정상 세포주에서는 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 결론적으로 MPMC는 기존의 암 화학 요법에 비해 활성이 유사하고 부작용이 최소화된 새로운 암 치료제 개발에 사용될 수 있는 유망한 항암 물질로 간주될 수 있다. .

키워드: 우유 단백질; Isabgol 껍질 점액질; 나베크 점액질; 우유 단백질 점액 복합체; 항암 활성

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1. 소개

암2020년에 약 천만 명이 사망할 전 세계 사망의 주요 원인입니다[1]. 조기 진단과 새로운 치료제 개발만이 암을 퇴치할 수 있는 유일한 희망입니다. 화학 요법, 방사선 치료와 같은 기존의 암 치료는 상대적으로 비용이 많이 들고 심각한 부작용을 동반합니다.

따라서, 과학 및 연구 관심은 기존 치료법에 비해 독성 부작용이 적은 것으로 간주되어 발암 가능성이 있는 천연 화합물(즉, 단백질, 다당류 및 폴리페놀)의 출처를 이용하는 경향이 있습니다.

다당류식물 공급원으로부터의 생물 활성 특성으로 인해 최근 관심이 증가하고 있습니다[2,3]. 생리활성 다당류와 폴리페놀은 유익한 약리학적 효과로 인해 과일, 채소, 곡물 및 허브와 같은 천연 식물 공급원에서 분리하는 데 많은 연구가 있었습니다[4].

Plantago ovata(Psyllium 또는 Isabgol) 및 Ziziphus Spina-Christi(Nabeg 또는 Sidr)는 생리활성 다당류의 공급원으로 알려져 있습니다. IHM과 NabM은 유망한 생리활성 물질로 선택되었습니다. 이전 연구에서는 우유 단백질과 IHM 및 NabM 복합체가 간 기능을 개선하고 심혈관 질환의 위험을 감소시키는 것으로 나타났습니다[5]. Isabgol husk는 설사, 변비, 궤양성 대장염, 과민성 대장 증후군, 고콜레스테롤혈증 및 당뇨병 치료에 효과적인 것으로 입증되었습니다. 또한 대장암에 대한 이사브골 껍질의 항암 효과는 섬유질 함량에 기인하며, 이는 통과 시간을 줄여 효과를 감소시키는 역할을 합니다. 이것은 장내 미생물총에 의한 담즙 대사 감소, 대변 부피 증가에 의한 담즙산 희석, 섬유 발효로 인한 미생물 담즙산 대사 변화, pH 감소 및 단쇄 지방산 생성, 또는 담즙산에 대한 직접 결합으로 이어질 것입니다. 담즙산을 억제하여 신진대사를 방해합니다[6]. Ziziphus Spina-Christi의 주요 생물학적 활성 성분은 비타민 C, 페놀, 플라보노이드 및 트리테르펜산입니다. 생체 활성에는 항암, 항균, 항당뇨병, 항증식 및 항산화 활성이 포함됩니다[7. Isabgol husk와 Nabeq 과일은 각각 Isabgol husk mucilage(IHM)와 Nabeq mucilage(NabM)의 생산에 사용됩니다[5].

한편, 암에 대한 단백질 기반 치료법은 낮은 세포독성, 강한 특이성, 변형 용이성과 같은 주요 특징으로 인해 관심이 증가하고 있다[8]. 필수 아미노산의 영양 요구를 제공하는 것 외에도 우유 단백질은 항산화, 면역 조절, 항당뇨병, 항균 및 항암 특성과 같은 많은 기능적 특성을 갖는 생물학적 거대 분자 중 하나입니다[9,10]. 예를 들어, 유제품 유래 펩타이드(즉, -카제인 및 1-카제인 단편90-95 및 90-96[Arg{10}}Tyr-Leu에서 분리된 -Casomorphins)의 항암 활성 -Gly-Tyr-Leu95-(Glu96)]) 소 우유에서 확인된 것은 우유 단백질이 영양가가 있을 뿐만 아니라 암 예방 및 치료 가능성도 있다는 가정을 뒷받침합니다 [11,12]

우유 단백질과 다당류(예: 우유 단백질-키토산 복합체) 간의 복합체는 천연 성분의 기능적 특성을 향상시키기 위한 시도로 이전에 생산되었습니다[13]. 가용성 및 준비 용이성으로 인해 이러한 복합체는 보다 저렴한 항암 요법의 개발에 사용될 가능성이 있습니다. 그러한 치료제는 덜 비싸고 현재 사용되는 화학 치료제와 비슷한 활성을 보일 것입니다.

소수성 및 정전기적 상호작용을 통한 비공유 결합은 우유 단백질과다당류[14]. 더욱이, 단백질은 pH 2에서 11 사이의 범위에서 다른 성분과의 상호작용에 대해 놀라운 탄력성을 보입니다. 특정 pH에서 단백질의 표면 반응성은 단백질 구조의 전개를 통해 증가합니다[15].

이러한 맥락에서 우리 그룹은 최근 인간 건강에 대한 우유 단백질 복합체의 기능적 역할에 초점을 맞추었습니다. 그러나 IHM 또는 NabM과의 우유 단백질 복합체는 항고지혈증 및 간 보호 특성을 나타냅니다[9]. 따라서 이전 연구를 기반으로 우유 단백질-다당류 복합체가 흥미로운 항암 활성을 가질 수 있다고 가정되었습니다. 또한 IHM 및 NabM과 우유 단백질 복합체의 항암 활성에 대한 연구를 수행한 간행물이 없습니다. 따라서 이 연구의 주요 목적은 아미노산 프로파일 및 이러한 복합체의 기능적 특성을 포함하여 새로 생산된 우유 단백질 점액 복합체의 물리화학적 특성을 특성화하는 것이었습니다. 또한 두 개의 인간 암 세포(MCF7 및 HEPG2)에 대한 IHM 및 NabM 점액을 함유한 우유 단백질 복합체의 항암 활성을 비암 세포주(Bi-1 및 MCF{7}}F ). 우리는 또한 생산된 우유 단백질 점액 복합체의 작용 방식에 대해 설명합니다.

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2. 결과 및 논의

2.1. 푸리에 변환 적외선(FTIR) 분광법

IHM, MP 및 MP/IHM의 적외선 스펙트럼은 그림 1A에 나와 있습니다. IHM의 스펙트럼은 100-1200 cm-1에서 arabinoxylans의 특성 밴드를, 1550 및 1650 cm-1에서 아미드 I 및 아미드 II 그룹에 대한 밴드를 각각 보여주었습니다. MP 스펙트럼은 각각 아미드 I(주로 단백질의 C=O 스트레칭) 및 우유 탄수화물에 해당하는 1700-1600 및 1200-900 cm-I에서 밴드를 보여줍니다[16]. IHM 및 MP의 앞서 언급한 피크는 IHM/MP 복합체의 스펙트럼에서 예약되었습니다. 유사하게, NabM에서 갈락투론산의 특성 밴드는 NabM/MP 복합체의 스펙트럼에서 유지되었습니다(그림 1B). 이것은 다당류 점액질과 MP 사이에 화학적 상호작용이 없음을 나타내므로 MP와 다당류(IHM 및 NabM) 사이의 제안된 정전기 인력 메커니즘을 확인합니다. 이러한 관찰은 정전기 및 소수성 상호작용을 통해 유청유 단백질과 펙틴 사이의 복합체 형성을 보고한 Vukic et al의 결과와 일치하여 복합체의 일관성이 좋습니다[17].

(A) Fourier-transform infrared spectra of MP, IHM, and MP/PHM. (B) Fourier-transform infrared spectra of MP, IHM, and MP/NabM. NabM: Nabeq mucilage, IHM; Isabgol husk mucilage, MP: milk proteins concentrate, MP/IHM: milk proteins/Isabgol husk mucilage complex, MP/NabM: milk proteins/Nabeq mucilage complex

2.2. MP 및 MPMC의 물리화학적 및 기능적 특성

벌크 밀도(BD), 탭 밀도(TD), Carr's Index 및 pH 측정 값은 표 1에 나열되어 있습니다. MP의 BD 및 TD는 IHM보다 높았고 IHM은 테스트 샘플의 가장 낮은 벌크 및 탭 밀도를 보였습니다. . 유사하게, MP/IHM 복합체는 유의하게 (p<0.05) lower="" bulk="" and="" tapped="" density="" compared="" to="" mp/nabm.="" the="" obtained="" results="" indicated="" that="" the="" distribution="" and="" solubility="" of="" mp="" have="" been="" improved="" by="" complexation="" with="" the="" ihm.="" carr's="" index="" is="" frequently="" used="" as="" an="" indication="" of="" the="" flowability="" of="" powders.="" the="" results="" in="" table="" 1="" show="" that="" carr's="" index="" of="" mpmc="" was="" significantly="" lower="" than="" ihm="" which="" indicated="" that="" nabm="" improved="" the="" flowability="" of="" mp.="" this="" was="" probably="" due="" to="" the="" lower="" carr's="" index="" value="" of="" mp(30.6±="" 0.10%)="" compared="" to="" ihm="" and="" nabm="" (57.58±0.14="" and="" 53.97±0.11%,="" respectively)which="" are="" vicious.ihm="" is="" alkaline="" (7.79="" ph)="" while="" mp="" and="" the="" complexes="" with="" polysaccharide="" mucilage="" were="" slightly="" acidic="" which="" came="" in="" accordance="" with="" previously="" reported="" results="">

WSI 및 WAI는 식품 기술에서 중요한 기능적 특징입니다. 표 1은 MP의 WSI 및 WAI가 IHM 및 NabM과의 복합화 후 유의하게 증가함을 보여줍니다. 이는 Isabgol 기반 물질이 물에 충분히 용해되어 물을 충분히 첨가한 후 농축 효과가 있어 수용성이 높기 때문일 가능성이 가장 큽니다[19]. 또한 Qaisrani et al. Isabgol husk의 arabinoxylans는 건조 중량의 10배까지 수분 보유 능력이 있다고 보고했습니다[20]. 또한 IHM이 NabM보다 WSI 및 WAI가 더 높기 때문에 MP/IHM이 MP/NabM보다 WSI 및 WAI가 더 높습니다. 또한 MPMC에 비해 MPMC의 WSI 퍼센트 증가는 치료 문제에 사용할 때 표적 활성 성분의 분산성을 증가시켰습니다[21]. 이것은 이러한 복합체가 MP보다 세포독성 효과가 있음을 입증한 항암 결과에서 분명했습니다.

Physicochemical and functional characteristics of MP, NabM, IHM, and MPMC

2.3. 생리활성 성분

2.3.1. PHM 및 NabM의 페놀 화합물

식품에는 항산화 및 항암 효능으로 작용하는 매우 중요한 생리 활성 화합물(즉, 페놀 및 플라보노이드)이 포함되어 있습니다. HPLC 분석은 그림 2와 같이 Nab 및 IHM에 많은 페놀 화합물의 존재를 확인하고 정량화했습니다. 결과는 갈산(177.96 mg/Kg), 카테콜(13.87 mg/Kg)과 같은 다양한 생물학적 활성 화합물의 함량이 높음을 보여줍니다. PHM 추출물 및 카테콜(410.72mg/Kg)의 p-하이드록시벤조산(24.02mg/Kg), 카테킨(5.93mg/Kg) 및 루틴(123.70mg/Kg) 및 p-하이드록시벤조산(426.71mg/Kg)클로로제닉 (72.05 mg/Kg) 루틴(1750.57 mg/Kg) 및 NabM의 로즈마린(1771.72 mg/Kg)(그림 2A,B). 이러한 화합물의 함량은 건강상의 이점에 매우 중요합니다. 페놀 화합물의 항암 효과는 이전에 보고되었습니다. 이 효과는 주로 이러한 화합물의 항산화 효과에 기인합니다.

2.3.2. MP 및 MPMC의 총 페놀, 플라보노이드 및 항산화 활성

여러 보고서에 따르면 항산화 특성을 나타내는 화합물은 대부분 항암 활성을 나타냅니다[22]. 총 페놀(TP) 및 총 플라보노이드(TF) 함량은 NabM, IHM, MP 및 이들의 복합체에서 결정되었습니다(그림 3A, B). 결과는 TP 및 TF가 IHM 및 MP/IHM에 비해 NabM 및 MP/NabM에서 더 높았다는 것을 나타내었습니다. 그러나 TP 및 TF 함량은 MPC에 비해 MP에서 유의하게 낮았다. 이러한 결과는 Singh et al.[23]이 보고한 데이터와 일치했습니다. NabM의 TP 및 TF는 각각 1.6 GAE mg/100g 건조 중량 및 47mg CE/100g 건조 중량임을 발견했습니다. MP/NabM 및 MP/IHM 복합체는 MP에 비해 각각 TP에서 309% 및 59%, TF에서 476% 및 123%의 유의한 증가를 보였습니다. MP를 IHM 및 NabM과 결합하면 IHM 및 NabM에 해당하는 TPC가 각각 23% 및 36% 손실되었습니다. TF는 MP와 복합될 때 IHM에서 44%, NabM에서 46%까지 감소했습니다. 이것은 MP의 낮은 TP와 TF 때문일 것입니다.

HPLC analysis of polyphenolic profiles of (A) IHM and (B) NabM

DPPH, ABTS 및 HS를 사용하는 MP와 비교하여 MP/IHM 및 MP/NabM의 잠재적 라디칼 소거 활성이 그림 3C-E에 나와 있습니다. 세 가지 항산화 활성에서 얻은 데이터는 NabM이 IHM보다 더 높은 항산화 활성을 나타냄을 나타내는 유사한 경향을 나타냈으며 이는 페놀 및

플라보노이드 함량. MP의 항산화 능력은 NabM 및 IHM과 복합체를 형성한 후 증가했습니다. ABTS 분석을 제외하고 NabM의 항산화 활성은 MP와의 접합에 의해 증가했습니다. 항산화 활성은 MPMC가 MP에 비해 더 높은 항산화 활성을 나타냈다. 우리의 가설은 MP와 다당류 사이의 가능한 상호작용을 가리키며 Li et al. [24]. 소거능과 페놀/플라보노이드 함량 사이에는 양의 상관관계가 있는 것으로 이전에 보고된 바 있습니다 5]. 그러나 우리는 황 함유 아미노산이 풍부한 새로운 생리 활성 펩타이드가 생성된다는 것을 배제 할 수 없으며, 이는 복합되지 않은 구성 요소에 비해 MPMC의 높은 항산화 활성을 설명합니다. 또한, 작은 펩타이드가 유청 분획에서 방출되어 높은 항산화 특성에 영향을 미칩니다[4]. 마지막으로, 페놀과 플라보노이드 함량은 다양한 암세포에 영향을 미칩니다. 또한, 시험관 내 세포 배양 분석 동안 이러한 활성 및 메커니즘이 관찰되었습니다. 페놀류의 항산화 및 항암 활성은 방향족 고리의 이중 결합 및 하이드록실 치환에 기인합니다[25].

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2.4.MP와 MPMC의 아미노산 프로파일

MP, NabM, MP/IHM 및 MP/NabMare의 아미노산 프로필은 그림 4에 나와 있습니다. MP의 아미노산 프로필과 IHM 및 NabM과의 복합체에는 큰 차이가 없었습니다. 이것은 MP와 다당류 점액질의 비공유 상호작용이 우유 단백질의 구성을 변화시키지 않는다는 것을 나타냅니다. 결과는 MP와 MPMC에서 글루탐산의 높은 함량을 보여줍니다(그림 4)[26].

Amino acid profile of MP, MP/IHM, and MP/NabM. MP: milk proteins concentrate, MP/IHM: milk proteins/Isabgol husk mucilage complex and MP/NabM: milk proteins/Nabeq mucilage complex.* essential amino acids

2.5. MP 및 MPMC의 유변학적 특성

2.5.1. 겉보기 점도

그림 S1은 다양한 rpm 값에서 단백질 샘플의 점도를 보여줍니다. IHM과 NabM은 저속 회전시 점도가 높으나 회전속도가 증가함에 따라 점도가 현저히 감소하였다. 이러한 결과는 전단율을 증가시키면 녹미(Monostrom iridium)의 수용성 점액의 겉보기 점도가 감소한다는 Chen 및 Che의 기록과 일치합니다[27].

그림 S1의 결과는 또한 MP와 IHM 및 NabM의 복합화가 MP의 겉보기 점도에서 상당한 증가(p 0.05 이하)를 초래했음을 보여줍니다. 이는 점도 향상 효과가 있는 IHM(하이드로콜로이드 재료)의 고유한 특성에 기인할 수 있습니다[28].

2.5.2.흐름 동작

우유 단백질과 그 복합체의 유동 거동(전단 응력/전단 속도 곡선)은 그림 S2에 나와 있습니다. 전단속도가 증가함에 따라 전단응력이 증가하였다. 전단응력과 전단속도 데이터를 거듭제곱법칙으로 변환하면 유동일관성지수(K)와 유동거동지수(n)의 값을 Table S1에 나타내었다. IHM과 MP/IHM이 가장 높은 유동일관성 지수를 나타내었다. 이것은 수성 매질에서 물을 유지하고 겔화하는 높은 용량으로 인해 IHM의 수용성 점액의 높은 점도 때문일 수 있습니다. 결과는 또한 IHIM, NabM 및 MP/IHM이 0.25 ~ 0.64 범위의 낮은 n 값으로 전단 박화 거동(비뉴턴 유체)을 가짐을 보여주었습니다. 이러한 결과는 Ziziphus mauritiana[29]의 물리화학적 특성을 연구한 Thanatcha와 Pranee에 따라 나온 것입니다. 반면 MP의 n값은 약 1(0.99)로 Newtonian flow를 나타낸다. 유사하게, MP/NabM 복합체의 n 값은 표 S1에 표시된 대로 0.95였습니다.

2.6.MP와 MPMC의 시차주사열량계

MP 및 IHIM 및 NabM과의 복합체의 열 안정성을 조사하기 위해 시차 주사 열량계가 사용되었습니다. MP 및 MPMC의 서모그램은 그림 S3에 나와 있고 DSC 매개변수는 표 2에 나와 있습니다. MP 서모그램에는 명확한 흡열 피크가 없었지만 MP/IHM 및 MP/NabM에 대한 넓은 흡열 피크. 이는 자유수의 점진적인 제거, NabM의 융점, 느린 겔화 및 단백질 변성 때문일 수 있습니다[30].

또한 MPMC는 표 2에 나타낸 바와 같이 MP/IHM 및 MP/NabM(각각 148.24도 및 121.4도)에 비해 MP의 낮은 변성 온도(101.44도)에서 관찰된 바와 같이 비복합 단백질보다 열안정성이 있음을 주목하였다. 더욱이, MP의 분해 온도는 302.3도로 기록된 반면, 350℃까지 온도 상승에 따라 MPMC의 분해는 관찰되지 않았다. 이러한 발견은 우유 단백질의 열적 안정성이 단백질 응집을 방지하는 페놀 화합물과의 상호작용에 의해 증가한다는 여러 연구와 일치합니다[2,31].

반응 동안 시스템 안팎으로 전달되는 열은 엔탈피(AH)입니다. MP/IHM 및 MP/NabM의 엔탈피가 비복합 MP의 엔탈피에 비해 높은 것은 우유 단백질(유청과 카제인) 간의 잠재적인 화학 반응과 고온에서 우유 단백질과 다당류 사이의 잠재적인 화학 반응(Maillard 반응) 때문일 수 있습니다. 31.

Differential scanning calorimetry (DSC) parameters of MP and MPMC *

2.7.MP와 MPMC의 투과전자현미경(TEM)

그림 5는 IHM, NabM, MP 및 MPMC의 미세 구조를 보여줍니다. MPMC의 입자크기는 나노범위(114-250 nm)이며 MP(191-300 nm)의 입자크기보다 작은 것을 알 수 있었다. 또한 MPMC의 TEM(그림 5D, E)은 형성된 복합체의 분기 패턴을 드러냈습니다. 이것은 우유 단백질과 다당류 사이의 정전기적 인력에 기인할 수 있습니다. Goh, et al. [32]. 또한 MP/NabM에 비해 MP/IHM의 더 큰 분지 구조는 그림 S1에 표시된 것처럼 더 높은 점도의 원인이 될 수 있습니다.

Transmission electron microscopy of (A) MP; (B) IHM; (C) NabM; (D) MP/IHM; and (E) MP/NabM. MP: milk proteins concentrate; MP/NabM: milk proteins/Nabeq mucilage complex; MP/IHM: milk proteins/Isabgol husk mucilage complex.

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2.8. MP 및 MPMC에 대한 생물학 연구

2.8.1. MP와 MPMC의 항암 활성

MP 및 MPMC의 다양한 농도(1, 5, 10 및 20 ug/mL)가 MCF-12F 및 Bij{ {7}} 정상 세포는 그림 6과 7에 나와 있습니다. MPMC는 HepG{10}} 및 MCF{11}} 세포에 대한 항암 효과를 각각 나타냅니다. 그림 6A, B. 용량 반응 곡선은 더 높은 농도에 반응하여 세포 생존력의 감소를 나타냈습니다. 반면 Bj{14}} 및 MCF{15}}F 정상 세포에 대한 MP 및 MPMC의 유의한 세포독성 효과는 관찰되지 않았습니다(그림 6C, D). 우리의 결과는 또한 MP/NabM이 HepG{17}} 및 MCF{18}} 암 세포주에 대해 더 높은 항암 활성을 나타내었으며 IC50 값은 각각 5.13 및 10.07ug/mL입니다. 또한, MP/IHM은 각각의 대조군과 비교하여 암세포주에 대해 중간 정도의 세포독성 효과를 나타냈다. 종합하면, 우리의 세포독성 데이터는 표 3에 나타난 바와 같이 MP를 IHM 및 NabM과 복합화하는 것이 복합화되지 않은 우유 단백질에 비해 항암 활성을 유의하게 향상시킨다는 것을 시사합니다. 또한 Hep G{25}} 세포가 MP 및 MPMC에 더 민감하다는 것이 분명했습니다. MCF{26}} 셀과 비교하여 IC50의 더 낮은 값으로 나타납니다.

Morphology of human cancer cell lines and normal cell lines; HepG-2 (A), MCF-7 (B), MCF12F (C), and BJ-1 (D) before and after treatment with MP and MPMC. MP: milk proteins concentrate; MP/NabM: milk proteins/Nabeq mucilage complex; MP/IHM: milk proteins/Isabgol husk mucilage complex.

Cancer cytotoxic IC50 of MP and MPMC on HEPG-2, MCF-7, MCF7-12F, and Bj-1 cells

유단백 유래 항종양 펩타이드의 항암 효과는 이미 보고된 바 있다. 이와 관련하여, Jung과 Hong[33]은 α-락트알부민의 트립신 가수분해물이 인간 골암 SJSA-1, 인간 결장직장암 HCT 116 및 인간 위암 NCI-N87 세포주에 세포독성 효과가 있음을 관찰하였다. o-락트알부민은 세포 표면 조절제와 상호작용하여 세포 성장 속도, 세포 내 칼슘 및 칼슘 수송 속도를 변화시키는 것으로 밝혀졌습니다[34]. 소의 락토페린이 MCF7 세포에서 용량 의존적 방식으로 세포자멸사를 유도했다는 점은 주목할 가치가 있습니다[35]. 또한 우유의 카제인 및 유청단백 분획물은 동물 모델에서 항종양 효과와 시험관 내 항증식 활성을 보였다[36]. 또한 Elzoghby et al.[37] 카제인 나노입자는 소수성 항암제인 플루타미드를 캡슐화하여 약물 방출을 제어하고 항종양 활성을 개선하며 간독성을 감소시키는 데 사용할 수 있다고 보고했습니다.

IHIM과 NabM의 항암 효과는 이전에 보고되었습니다[6,38]. MP와 MPMC의 세포독성 효과는 대장암에 대한 항암 활성을 나타내는 것으로 보고된 글루타민, 아르기닌, 시스테인과 같은 아미노산의 존재에 기인할 수 있다[39]. 이러한 결과는 MPMC의 높은 글루탐산 함량과 일치합니다(그림 5).

2.8.2. p53, Bax, Caspase-3 및 Bd-2 단백질 수준 측정

MPMC의 세포독성 기전을 조사하기 위해 HepG-2, MCF-7에서 apoptosis marker protein p53, Bax, Caspase-3 및 Bcl{2}}의 수준을 측정했습니다. , Bj-1 및 MCF-12MPMC의 IC0로 처리된 F 세포주(그림 8). pro-and-apoptotic marker의 수준은 암세포주에서 apoptosis 유도와 관련이 있습니다[40,41]. 결과는 MP/NabM과 MP/IH가 HepG{13}} 및 MCF{14}}에서 세포자멸사를 강화했지만 MCF{15}}F 및 Bj{16}} 세포주에서는 그렇지 않은 것으로 나타났습니다. caspase{17}}, p53, Bax의 수준은 각 대조군에 비해 유의하게 증가한 반면(그림 8), Bcl{20}} 단백질은 모든 처리에서 감소했습니다. 흥미롭게도 MP는 또한 apoptosis protein marker에서 상당한 변화를 보였다. 이것은 항암 연구의 결과와 일치했으며 위에서 논의한 많은 우유 단백질 유래 펩타이드의 세포 독성 효과라고 할 수 있습니다(섹션 2.8.1).

2.8.3. RNH1 플라스미드의 산화적 절단에 대한 MPMC에 의한 DNA 손상 보호

RNH1 플라스미드 DNA는 아가로스 겔 전기영동에서 열린 원형, 선형 및 초나선형 원형 DNA로 위에서 아래로 정렬된 세 가지 형태를 가지고 있습니다. Fenton 시약에 의한 산화 스트레스는 DNA 손상을 유발했습니다. 결과적으로 DNA 형태의 수준이 변경됩니다. 그러나 열린 원형 및 선형 형태는 DNA 손상을 나타내고 슈퍼코일 원형 DNA는 더 많은 보호 가능성을 나타냅니다. 이 분석에서 우리는 IC50에서 MP와 MPMC가 산화 스트레스에 대한 반응으로 슈퍼코일 원형 형태의 분해를 방지할 수 있는지 여부를 테스트했습니다. 그 결과 MP/NabM과 MP/IHM 모두 DNA 대조군과 유사한 높은 보호 능력을 보였다(레인 3 및 4, 그림 9A). 한편, MP로 처리한 DNA는 대조군과 Fenton's 시약만을 처리한 DNA(lane 5)에 비해 유의한 차이가 관찰되지 않았다.

2.8.4. 게놈 DNA의 산화적 절단에 대한 MPMC에 의한 DNA 손상 보호

PCR 기술을 사용하여 Fenton 반응에 의해 유도된 게놈 DNA 손상에 대한 MPMC의 보호 특성을 조사했습니다. 일반적으로 DNA 손상은 특정 유전자의 복제 수를 감소시키므로 겔 전기영동에서 더 낮은 밴드 강도를 생성합니다. MP, MP/NabM 및 MP/IHM의 IC5{1}}가 있거나 없는 Fenton 시약과 함께 배양된 혈액 게놈 DNA의 밴드 밀도 MTHFR 유전자를 테스트했습니다. MP/NabM 및 MP/IHM(레인 3 및 4, 그림 9B)이 DNA 손상을 방지하고 이후 MTHFR 템플릿 절단 부위를 보호하는 것으로 밝혀졌습니다. 따라서, 각각의 대조군에 비해 전기영동 겔에서 더 높은 PCR 생성물 밴드 강도가 생성되었다(도 9B). 이러한 결과는 MPMC의 항산화 활성이 DNA 손상을 매개하는 자유 라디칼 생성을 억제한다는 것을 나타냅니다.

2.8.5. 유전자 발현

apoptosis protein marker에서 얻은 데이터와 일치하게, RT-qPCR 결과 HepG-2, MCF{2}} 세포와 MP, MP/NabM 및 MP/IHM의 배양이 pro- apoptotic mRNA markers, 즉 Casp3, p53, Bax의 발현을 억제하는 반면, anti-apoptotic marker인 Bcl{7}}의 발현 수준은 유의하게 하향조절되었다(Figure 10A-D). 카스파제는 세포자멸사 개시 및 유지에 중요한 역할을 하는 행위자 단백질입니다. 그러나, caspase 3 단백질의 상향 조절은 Bax 유도 시토크롬 c 방출과 함께 미토콘드리아 막의 붕괴와 caspase 3의 후속 참여 [42]. Bcl{20}} 발현의 감소와 함께 Casp3, p53 및 Bax의 상향 조절은 MP, MP/NabM 및 MP/IHM이 세포자멸사를 유발하는 것으로 나타났습니다. 이와 관련하여 p53의 상향 조절은 Bax의 발현을 자극하고, 이는 차례로 시토크롬 c 방출을 유도하고, 이어서 caspase-9 및 -3 활성화를 유도합니다. 그러나 항세포자멸사인 Bcl{24}}은 사이토크롬 c 방출을 억제하는 것으로 알려져 있으며[43], 치료는 항세포자멸사 마커 유전자인 Bcl{28}} MP/NabM 및 MP/IHM 처리, 이는 반대되지 않는 Bax 유도 시토크롬 c 방출 및 후속 세포자멸사를 촉진합니다. 이 연구에서 MP/NabM은 MP/IHM 및 MP와 비교하여 심각하게 매개된 세포자멸사를 (그림 10)에서 관찰했습니다. MP/NabMor MP/IHM의 관찰된 항암 효과는 단백질과 mRNA 전사 수준이 모두 상당히 상향 조절되었기 때문에 ap{32}}의존성 세포자멸사 경로의 조절을 통해 진행됩니다.