1부: 급성 신장 손상에서 만성 신장 질환으로의 전환에서 SIK1의 역할
Mar 25, 2022
연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com
Jinxiu Hul, JiaoQiaot, Qun Yul, Bing Liu1 & et al.
배경
급성 신장 손상사구체여과율(GFR)의 감소와 혈청 크레아티닌의 증가를 특징으로 하는 흔한 질환인 (AKI)[1]는 CKD의 발병 및 진행에 대한 위험인자로 간주된다[2,3]. 최근 AKI-CKD(급성신장손상이 만성신장질환으로) 전환은 신장 질환 연구에서 핫스팟 중 하나가 되었습니다. 염증, EMT 및 섬유화가 AKI-CKD의 진행에 중요한 역할을 한다고 보고되지만(급성신장손상이 만성신장질환으로)전이 [4,5], AKI-CKD의 정확한 분자 메커니즘(급성신장손상이 만성신장질환으로)전환은 여전히 불분명합니다.
신장 질환을 치료하고 신부전을 예방하는 cistanche
염 유도성 키나제 1(SIK1)은 대사, 세포 생존 및 성장을 조절하는 데 중추적인 역할을 하는 AMP 활성 단백질 키나제(AMPK) 계열의 구성원입니다[6, 7]. 연구에 따르면 SIK1의 억제는(염 유도성 키나제 1)EMT를 촉진하여 종양[8-10]의 이동 및 전이를 유발합니다. 게다가 SIK1은(염 유도성 키나제 1)TLR{0}유도된 NF-kB의 활성화와 전염증성 사이토카인의 발현 감소를 부정적으로 조절합니다[11]. 또한, 새로운 증거는 SIK1 사이의 연관성을 보여주었습니다.(염 유도성 키나제 1)및 신장 질환 [6,12]. 예를 들어, SIK1의 상향 조절(염 유도성 키나제 1)은 사구체 경화증과 같은 섬유성 장애에 관여하는 FN 및 PAI{1}}의 발현을 억제하여 높은 포도당 유도 간질 세포 증식과 세포외 기질(ECM) 축적을 역전시켰습니다[6,13]. 따라서 우리는 SIK1이(염 유도성 키나제 1)AKI-CKD의 진행에 관여할 수 있습니다.(급성신장손상이 만성신장질환으로)EMT, 염증 및 신장 섬유증을 특징으로 하는 이행.
WNT/-카테닌 경로는 장기 발달, 조직 항상성 및 발암과 같은 다양한 생물학적 과정을 조절하는 복잡하고 고도로 보존된 신호 전달 경로입니다[14, 15]. 정상적인 성인 신장에서는 침묵하지만 급성 신장 손상, 당뇨병성 신병증, 간질 섬유증, 낭포성 신장 질환을 비롯한 다양한 신장 질환에서 재활성화되는 것으로 밝혀졌습니다[16]. 또한 WNT/-카테닌 경로의 억제가 신장 섬유증을 개선하여 AKI-CKD의 진행을 지연시키는 것으로 보고됩니다.(급성신장손상이 만성신장질환으로)I/R로 인한 부상 [17]. 그러나 SIK1 여부(염 유도성 키나제 1)AKI-CKD에 참여할 수 있습니다.(급성신장손상이 만성신장질환으로)WNT/-카테닌 경로 조절에 의한 전이는 더 명확하게 남아 있습니다.
EMT 전사 인자인 Snail 및 Twistl이 신장 섬유증[18-20]의 발병기전에서 중요한 역할을 한다는 새로운 증거가 있습니다. 근위 세뇨관 상피 세포에서 Twistl 또는 Snail의 조건부 결실이 EMT를 억제하여 마우스에서 실험적으로 유도된 신장 섬유증에서 간질 섬유증을 약화시키는 것으로 보고되었습니다[21]. Snail과 Twist1이 WNT/-catenin 경로의 하류에 위치한 중요한 분자임을 고려할 때, 우리는 이들이 SIK1에서도 중요한 역할을 할 수 있다고 추측했습니다.(염 유도성 키나제 1)매개된 AKI-CKD(급성신장손상이 만성신장질환으로)이행.
따라서 본 연구에서는 SIK1(염 유도성 키나제 1) AKI-CKD(급성신장손상이 만성신장질환으로)신 섬유증의 임상 예방 및 치료를 위한 새로운 치료 표적을 제공하고 AKI-CKD의 진행을 지연시키는 새로운 방법을 제공할 전환(급성신장손상이 만성신장질환으로)이행.
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재료 및 방법
환자 및 조직 샘플
이 연구는 산둥 대학교 부속 산동성 병원의 임상 연구 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. AKI(급성 신장 손상)는 신장 생검을 기반으로 진단되었으며 대조군의 신장 샘플은 외과 적 절제술을받은 신장 종양 환자의 주변 암 조직에서 얻었습니다. 조직 샘플은 액체 질소에 보존되었으며 헬싱키 선언에 따라 모든 환자가 동의서에 서명했습니다.
AAV{0}Sik1 건설(염 유도성 키나제 1)
재조합 아데노 관련 바이러스(AAV9-Sik1) 및 아데노 관련 바이러스 음성 대조군(AAV9-NC)은 GENECHEM(중국 상하이)에서 제작했습니다. 재조합 AAV9-Sik1 adeno 관련 바이러스 벡터 GV467은 프로모터, 항체 코딩 영역, EGFP 녹색 형광 단백질 코딩 영역 및 3FLAG 태그 단백질 코딩 영역을 포함합니다. AAV9 벡터가 신장을 형질도입하는 능력이 검증되었습니다(추가 파일 1).
동물 및 모델링 방법
모델링 및 후속 실험 프로그램은 Shandong University의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 4-6주령 및 체중 15-20g의 C57BL/6 마우스는 Shandong University의 실험 동물 센터에서 공급되었으며 무작위로 4개의 그룹으로 할당되었습니다: 대조군(대조군), AA 처리된 정상 마우스( AA), AAV9-Sik1 그룹으로 처리된 AA 마우스(AAV9-Sik1 plus AA), AAV9-NC 그룹으로 처리된 AA 마우스(AAV9-NC + AA) . AA 그룹의 마우스에는 AA(10 mg/kg)를 복강 내 주사한 반면, 대조군의 마우스에는 PBS를 주사하였다. AA 주입 후 3일, 7일, 14일, 28일에 마우스의 24시간 소변을 대사 케이지에 수집하고 원심분리 후 상등액을{18}}도에 보관했습니다. 혈액을 3000r에서 10분 동안 원심분리하고 상등액을 0.24시간에 보관하여 요단백, 혈청 크레아티닌(Scr) 및 혈액 요소 질소(BUN)를 자동 생화학 분석기로 측정했습니다. 혈청 IL{23}} 및 TNF-는 ELSA에 의해 검출되었습니다. 그런 다음, 마우스를 희생시키고 무게를 잰다. 그 후 신장을 절제하고 무게를 잰다. 모든 신장 샘플은 조직학적 염색을 위해 4% 파라포름알데히드에 고정된 부분과 Real-Time PCR 및 웨스턴 블롯 검출을 위해{26}}도 이하로 보관된 부분 중 하나를 두 부분으로 나누었습니다.
조직학 및 면역조직화학
4% 파라포름알데히드에 고정한 후 신장 샘플을 탈수하고 투명하게 파라핀에 포매하고 4μm 두께의 조각으로 절단했습니다. 그 후, 슬라이드를 탈랍하고, 수화하고, 염색하였다. 신장 조직학적 분석을 위해 제조사의 지침에 따라 HE 염색, PAS 염색 및 Masson's trichrome 염색을 사용하였다. 면역 조직 화학적 분석을 위해 섹션을 SIK1에 대한 1차 항체와 함께 배양했습니다.(염 유도성 키나제 1)(51045-1-AP, Proteintech, USA), E-cadherin(20874-1-AP, Proteintech, USA), -SMA(ab32575, Abcam, USA), COL1(bs-10423R, Bioss , 베이징, 중국) 밤 4도. 2차 항체로 배양한 후 DAB를 첨가하고 hematoxylin으로 핵 대조염색을 하였다. 마지막으로 현미경(Leica, Germany)으로 영상을 관찰하였다. SIK1에 대한 양성 염색 비율(염 유도성 키나제 1), E-cadherin, -SMA 및 COL1은 정량적 Image-Pro plus 6.{4}} 소프트웨어(Media Cybernetics, Silver Spring, MD)를 사용하여 측정되었습니다[22].
세포 배양 및 치료
인간 근위 세뇨관 상피 세포(HK2)를 37℃에서 10% 소태아혈청(FBS)(Gibco, USA)과 1% penicillin-streptomycin(Sigma, USA)이 보충된 DMEM 배지(Gibco, USA)에서 배양하였다. 5% CO를 포함하는 습한 대기. Aristolochic acid(AA)(Sigma, USA)를 DMSO에 1 mg/mL로 용해시키고 세포를 10 μmol/L, 20 μmol/L, 40 μmol/L, 60 μmol/L의 최종 농도로 처리하고, 대조군에는 동일한 양의 DMSO를 처리하였다.
Lentiviral vector transduction 및 siRNA transfection lentiviral shRNA는 SIK1을 표적으로 합니다.(염 유도성 키나제 1), -카테닌 및 스크램블된 shRNA, 뿐만 아니라 SIK1에 대한 렌티바이러스 과발현 벡터(염 유도성 키나제 1)및 빈 대조군 벡터는 Cyagen(Guangzhou, China)에 의해 구축되었습니다. 표적 서열은 다음과 같이 나열됩니다: SIKI shRNA:5'-GCGCGTGCATTGATTACTATC-3';
사막의 시스턴치 효능: 만성 신장 질환 치료
결과
SIK1(염 유도성 키나제 1)AKI에서 하향 규제되었습니다.(급성 신장 손상)
SIK1을 고려하면(염 유도성 키나제 1)신장 손상에 중요한 역할을 하는 우리는 먼저 SIK1의 발현을 감지했습니다.(염 유도성 키나제 1)AKI의 신장 조직에서(급성 신장 손상)환자와 AKI(급성 신장 손상)쥐. 면역조직화학염색은 환자뿐만 아니라 생쥐에서도 SIK1(염 유도성 키나제 1)통제에서 세뇨관의 발현은 AKI에서보다 더 높습니다.(급성 신장 손상)SIK1을 나타내는 그룹(염 유도성 키나제 1)AKI 기간 동안 하향 조정되었습니다.(급성 신장 손상)(그림 1a,b). 또한, 우리는 AKI의 신장 샘플에서 조직 병리학 적 변화를 분석하기 위해 HE 및 Masson's trichrome 염색을 수행했습니다.(급성 신장 손상)환자(그림 1c). 대조군과 비교하여, HE 염색에 의해 AKI 군에서 신세뇨관 상피 세포의 종창, 액포 변성 및 간질 부종이 관찰되었다. 또한 Masson's trichrome 염색을 통해 AKI군에서 대조군과 비교하여 납작한 관형 세포, 분리된 브러시 경계, 확대된 관형 린넨이 관찰되었다. 종합하면, 이러한 모든 결과는 SIK1이(염 유도성 키나제 1)관 손상의 역할을 할 수 있습니다.
그림 1 SIK1은 AKI에서 하향 조절되었습니다.(급성 신장 손상).a Control 및 AKI에서 SIK1의 대표적인 면역조직화학 염색 이미지(급성 신장 손상)환자. 스케일 바{0}} μm. 그래프는 면역 조직 화학적으로 염색된 섹션에서 SIK1의 정량 분석을 보여주었습니다.b 대조군 및 AKI에서 SIK1의 대표적인 면역 조직 화학적 염색 이미지(급성 신장 손상)쥐. 스케일 바{0}} μm. 그래프는 면역 조직 화학적으로 염색된 섹션에서 SIK1의 정량 분석을 보여주었습니다. c AKI의 신장 조직에서 HE 및 Masson's trichrome 염색의 대표적인 이미지(급성 신장 손상)환자. 스케일 바{0}} μm. 데이터는 mean±sd *P로 표시됩니다.<0.05 vs="" control.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
SIK1(염 유도성 키나제 1)AA 유발 AKI-CKD에서 하향 조절되었습니다.(급성신장손상이 만성신장질환으로)전환 마우스
AKI-CKD의 마우스 모델을 얻으려면(급성신장손상이 만성신장질환으로)전환, 우리는 AA를 마우스에 복강 내 주사했습니다. 대조군과 비교하여, AA 처리된 마우스는 염증 인자, EMT 및 신장 섬유증의 증가된 생성을 나타내었다(도 2a-d). 또한, 신장 지수, 혈청 Scr, BUN 및 24시간 요 단백은 AA 처리 시 강화되었습니다(그림 2e). 또한 AA는 신장 구조를 손상시켜 세뇨관 상피 세포 위축, 석회 확대 및 세뇨관 간질에서 콜라겐 섬유 침착의 다른 정도를 유발합니다(그림 2f). 위의 모든 것은 AA 유발 AKI-CKD가(급성신장손상이 만성신장질환으로)전환 모델이 성공적으로 수립되었습니다. SIK1의 역할 탐색(염 유도성 키나제 1)AA 유발 AKI-CKD에서(급성신장손상이 만성신장질환으로) 전환, 우리는 AA를 주입한 쥐의 신장 샘플에서 그 발현을 평가했습니다. SIK1을 찾았습니다(염 유도성 키나제 1)및 p-SIK1(염 유도성 키나제 1)(Thr182)는 AA 주입 후 시간 의존적으로 감소했으며(그림 2g), 이는 SIK1의 잠재적 역할을 나타냅니다.(염 유도성 키나제 1)AA 유발 AKI-CKD 조절(급성신장손상이 만성신장질환으로)이행.
그림 2 SIK1은 AA 유발 AKI-CKD에서 하향 조절되었습니다.(급성신장손상이 만성신장질환으로)전환 마우스.IL{0}}의 ELISA 분석 및 다양한 마우스 그룹에서의 TNF-발현. b 염증 및 섬유증 마커(Caspase1/p20/p10, FN 및 COL1) 발현의 웨스턴 블롯 및 실시간 PCR 분석; c EMT 마커(E-cadherin, Vimentin 및 -SMA) 발현의 웨스턴 블롯 및 실시간 PCR 분석. d 다양한 마우스 그룹에서 E-cadherin의 대표적인 면역조직화학 염색 이미지. 스케일 바{11}} μm. 그래프는 면역 조직 화학적으로 염색된 섹션에서 E-cadherin의 정량 분석을 보여주었습니다. e 다른 그룹의 마우스에서 신장 지수, Scr, BUN 및 24시간 소변 단백질 수준. f 다른 그룹의 마우스에서 신장 조직의 대표적인 조직학적 염색(HE, PAS 및 Masson의 삼색 염색) 이미지. 스케일 바{14}} μm. g C57BL/6 마우스에서 SIK1 및 p-SIK(Thr182) 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석. 데이터는 mean±sd *P로 표시됩니다.<0.05 vs="" control.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
SIK1의 과발현(염 유도성 키나제 1)AA 유발 AKI-CKD 완화(급성신장손상이 만성신장질환으로)이행
SIK1의 기능을 지정하려면(염 유도성 키나제 1)AA 유발 AKI-CKD에서(급성신장손상이 만성신장질환으로)전환, 우리는 AAV{0}}SikI를 쥐의 꼬리 정맥에 주입하여 SIK1을 과발현했습니다(염 유도성 키나제 1). AAV{0}}Sik1을 주사한 후 신장 지수, Scr, BUN 및 24시간 요단백의 감소 수준으로 입증된 바와 같이 AA 유발 신장 기능 장애가 유의하게 개선되었음을 발견했습니다(그림 3a). Real-time PCR에서 AAV9-Sik1(염 유도성 키나제 1)완화된 AA 유발 염증 반응(그림 3b). 또한 AAV9-Sik1(염 유도성 키나제 1)AA에 의해 유발된 조직병리학적 손상을 유의하게 개선시켰다(Fig. 3c). 또한 면역조직화학염색 결과 AAV{1}}Sik1이(염 유도성 키나제 1)AA 유발 AKI-CKD 과정에서 간질 섬유증 및 EMT 완화(급성신장손상이 만성신장질환으로)전환(그림 3d). 전반적으로 이러한 결과는 SIK1이(염 유도성 키나제 1)AA 유발 AKI-CKD에서 보호 역할 수행(급성신장손상이 만성신장질환으로)이행.
cistanche 건강상의 이점: 신장 기능 개선
SIK1(염 유도성 키나제 1)AA 처리된 HK2 세포에서 하향 조절되었습니다. 많은 연구에서 신장의 근위 세뇨관이 AKI 손상의 주요 표적 중 하나임을 보여주었습니다.(급성 신장 손상)근위 세뇨관의 손상은 AKI-CKD의 발병에 중요한 병태생리학적 역할을 할 수 있습니다.(급성신장손상이 만성신장질환으로)이행. SIK1 여부를 추가로 평가하려면(염 유도성 키나제 1)시험관 내에서 하향 조절되었고, 우리는 이 연구에서 HK2 세포에 초점을 맞췄습니다. CCK8 분석을 수행하여 후속 실험을 위한 최적 농도로 10μmol/L AA를 선택합니다(추가 파일 2). 일관되게, AA 처리는 HK2 세포에서 증가된 염증, EMT 및 섬유증을 나타내었으며(도 4a-c), 이는 시험관내에서 AA-유도된 HK2 세포 손상을 시사한다. 그 후, 우리는 SIK1의 단백질 수준을 조사했습니다.(염 유도성 키나제 1)현저하게 감소된 SIK1을 관찰했습니다.(염 유도성 키나제 1)및 AA 존재하에 HK2 세포에서 p-SIK1(Thr182) (그림 4d). 또한 SIK1의 위치를 감지했습니다.(염 유도성 키나제 1)면역형광염색에 의한 AA 노출 전후의 HK2 세포의 단백질. 자극되지 않은 세포에서 SIK1(염 유도성 키나제 1)핵과 세포질 모두에서 관찰되었다. AA로 처리하면 SIK1의 발현(염 유도성 키나제 1)축소되었고 SIK1(염 유도성 키나제 1)핵에서 점차적으로 검출되었습니다(추가 파일 3). 종합적으로, 이러한 결과는 SIK1이 AA-유도 HK2 세포 손상에 관여한다는 것을 설명했습니다.
그림 3 SIK1의 과발현은 AA 유발 AKI-CKD를 완화(급성신장손상이 만성신장질환으로)이행.ㅏ. 다른 그룹의 마우스에서 신장 지수, Scr, BUN 및 24시간 요 단백질 수준. b 다양한 그룹의 마우스에서 Caspase 1 및 IL{3}} mRNA 수준의 실시간 PCR 분석. c HE, PAS 및 Masson's trichrome 염색을 사용하여 조직학적 변화와 세뇨관 간질 섬유증의 정도를 평가했습니다. 스케일 바=50 µm. d 다양한 마우스 그룹에서 E-cadherin, -SMA 및 COLI 단백질의 대표적인 면역조직화학 염색 이미지. 스케일 바=50 µm. 그래프는 면역 조직 화학적으로 염색된 섹션에서 E-cadherin, -SMA 및 COL1의 정량 분석을 보여주었습니다. 데이터는 평균 ± sd *P로 표시됩니다.< 0.05="" vs="" control,="">< 0.05="" vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
cistanche 추출물: 신장 기능 개선
SIK1의 과발현(염 유도성 키나제 1)개선된 AA 유도 HK2 세포 손상
SIK1의 역할을 더욱 명확히 하기 위해(염 유도성 키나제 1)AA 유발 HK2 세포 손상에서 우리는 SIK1을 안정적으로 상향 조절하는 세포주를 구축했습니다.(염 유도성 키나제 1)HK2 세포의 렌티바이러스 감염(추가 파일 4). SIK1의 과발현은 AA 단독으로 자극된 대조군 세포와 비교할 때 유의하게 증가된 E-cadherin 및 Caspasel/p20/p10, Vimentin, COLI 및 Fspl을 억제했습니다(그림 4e, f). 게다가 SIK1의 과발현(염 유도성 키나제 1)AA에 의해 유도된 HK2 세포의 이동 능력을 억제하였다(그림 4g). 함께, 이러한 발견은 SIK1이(염 유도성 키나제 1)HK2 세포에서 AA 유발 손상에 대해 보호했습니다.
도 4 SIK1은 AA 처리된 HK2 세포에서 하향 조절되었고 SIK1의 과발현은 AA-유도 HK2 세포 손상을 개선시켰다.ㅏ. 0시간, 24시간, 48시간, 72시간 b 0시간, 24시간, 48시간 동안 10μmol/L AA로 처리된 HK2 세포에서 Caspase 1/p20/p10, E-cadherin, ZO{12}}, Vimentin 및 -SMA 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석, 및 72시간, 처리 72시간 후 가장 큰 효과. -액틴을 대조군으로 사용하였다. c 72시간 동안 10μmol/L AA로 처리된 HK2 세포에서 초기 섬유증 지표(COLI, PAI{23}} 및 MMP9) mRNA 수준의 실시간 PCR 분석. d 0시간, 24시간, 48시간 및 72시간 동안 10μmol/L AA로 처리된 HK2 세포에서 p-SIK1(Thr182) 및 SIK1 수준의 웨스턴 블롯 분석. e 10 µmol/L AA 존재하에서 SIK1 벡터(SIK1 렌티바이러스 과발현 벡터)로 처리되거나 10 µmol로 처리된 HK2 세포에서 Caspase1/p20/p10, E-cadherin, Vimentin, Fsp1 및 COL1의 Western blot 분석 /L AA 단독으로 72시간 동안. f HK2 세포에서 E-cadherin 및 Vimentin의 대표적인 면역형광 이미지. 스케일 바{52}} μm. g HK2 세포의 대표적인 이동 결과. 스케일 바{54}} μm. 데이터는 mean±sd *P로 표시됩니다.<0.05 vs="" control,=""><0.05 vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
cistanche Deserticola 추출물: 신장 질환 치료
SIK1(염 유도성 키나제 1)생체 내 및 시험관 내에서 조절된 WNT/-카테닌 신호 전달 경로
AKI-CKD에서 WNT/-카테닌 경로의 중요한 역할 고려(급성신장손상이 만성신장질환으로)전환, 우리는 SIK1(염 유도성 키나제 1)WNT/-카테닌 경로를 조절했다. 생체 내 실험에서 우리는 SIK1의 과발현을 관찰했습니다.(염 유도성 키나제 1)AA 유발 AKI-CKD에서 WNT1, p{1}}카테닌(Y654) 및 핵 카테닌의 단백질 수준 억제(급성신장손상이 만성신장질환으로)마우스(그림 5a). SIK1 여부를 더 조사하려면(염 유도성 키나제 1)시험관 내에서 WNT/-카테닌 경로를 조절하고, 우리는 SIK1의 발현을 침묵시켰다(염 유도성 키나제 1)HK2 세포에서 shRNA에 의해 (추가 파일 5). 생체 내 결과와 일치하게, SIK1의 침묵은 β-카테닌, TCF4 및 LEF1 mRNA 수준을 현저하게 증가시켰습니다(그림 5b). 게다가 SIK1의 넉다운(염 유도성 키나제 1)-catenin 및 p{2}}catenin(Y654)의 단백질 수준을 증가시켰습니다(그림 5c). 또한 SIK1의 넉다운(염 유도성 키나제 1)-catenin의 핵 전위를 촉진했습니다(그림 5d). 종합적으로, 이러한 데이터는 SIK1이(염 유도성 키나제 1)생체 내 및 시험관 내에서 WNT/-카테닌 경로를 조절했습니다.
도 5 SIK1은 생체내 및 시험관내에서 WNT/-카테닌 경로를 조절한다.ㅏ. 다른 그룹의 마우스에서 SIK1, WNT1,p{2}}카테닌(Y654) 및 핵-카테닌 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석. b SIK1 shRNA 또는 Scramble shRNA로 처리된 HK2 세포에서 -catenin, TCF4 및 LEF1의 실시간 PCR 분석. c SIK1 shRNA 또는 Scramble shRNA로 처리된 HK2 세포의 웨스턴 블롯 분석 -카테닌 및 p{12}}카테닌(Y654).d HK2 세포에서 -카테닌의 대표적인 면역형광 이미지. 스케일 바{18}} 음. 데이터는 asmean±sd*P로 표시됩니다.<0.05 ys="" control.=""><0.05 ys="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
WNT/-카테닌 신호 전달 경로는 AA 유도 HK2 세포 손상에 관여합니다
WNT/ -카테닌 경로가 AA로 인한 HK2 세포 손상에 역할을 하는지 알아보기 위해 AA 처리 후 WNT1, 핵 -카테닌 및 p{5}}카테닌(Y654)의 발현 수준을 테스트했습니다. Western blot 결과, AA 자극 후 WNT1, 핵-카테닌, p- -카테닌(Y654)이 유의하게 증가하는 것으로 나타났습니다(추가 파일 6a). 게다가, 면역형광 염색은 α-카테닌의 핵 전위를 나타내었고(추가 파일 6b), 이는 AA 자극이 WNT/-카테닌 신호 전달 경로를 활성화할 수 있음을 시사합니다. -카테닌이 WNT/-카테닌 경로의 중심 구성요소임을 고려하면, -카테닌의 조절이 AA-유도 HK2 세포 손상을 조절하는지 여부가 궁금합니다. 따라서 우리는 HK2 세포에서 shRNA lentivirus에 의해 -catenin을 안정적으로 녹다운시켰다(추가 파일 6c). 그리고 우리는 α-catenin knockdown이 AA에 의해 유도된 Caspasel, IL{25}}, Vimentin, PAI{26}}, MMP9 발현을 손상시키고 E-cadherin 발현을 촉진시키는 것을 관찰하였다(Fig. 6a, b). 더욱이, AA로 자극된 α-catenin shRNA 세포는 AA 단독으로 자극된 α-catenin 대조군 세포와 비교하여 유의하게 감소된 이동을 나타냈다(도 6c). 종합하면, 이러한 발견은 WNT/-카테닌 경로가 AA-유도된 HK2 세포 손상에 관여함을 시사하였다.
그림 6 WNT/B-카테닌 신호전달 경로는 AA-유도 HK2 세포 손상에 관여합니다.HK2 세포는 10 umol/LAA 존재 하에 B-카테닌 shRNA 또는 스크램블 shRNA로 처리되었습니다. Caspase1.L-1BE-cadherin.Vimentin, PA/-1의 실시간 PCR 분석 및 HK2 세포의 MMP9 mRNA 수준. b HK2 세포에서 E-cadherin 및 Vimentin의 대표적인 면역형광 이미지. 축척 막대{12}} um.c HK2 셀의 대표적인 마이그레이션 결과입니다. 스케일 바{14}} 음. 데이터는 mean±sd*P로 표시됩니다.<0.05 vs="" control,=""><0.05 vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
SIK1에는 WNT/-카테닌 신호 전달 경로가 필요합니다.(염 유도성 키나제 1)AA에 의해 유도된 매개된 HK2 세포 손상
SIK1 여부를 연구하려면(염 유도성 키나제 1)WNT/-카테닌 신호 전달 경로를 통한 조절된 AA-유도 HK2 세포 손상, -카테닌은 SIK1에서 추가로 감소됨(염 유도성 키나제 1)녹다운 HK2 세포. SIK1 녹다운 세포와 비교하여 -catenin의 추가 녹다운은 E-cadherin의 mRNA 수준을 증가시키면서 Caspasel, COL1 및 Vimentin의 mRNA 수준을 감소시켰다(그림 7a). West-ern blot의 결과는 real-time PCR과 일치했으며, -catenin 및 SIK1의 침묵이 SIK1에 의해 유도된 E-cadherin의 하향 조절, Caspasel/p20/p10 및 Vimentin의 상향 조절을 역전시켰음을 보여줍니다.(염 유도성 키나제 1)녹다운(그림 7b).
종합적으로, 이러한 결과는 β-카테닌의 억제가 SIK1에 의해 매개되는 염증 반응, EMT 및 섬유증 진행을 역전시킨다는 것을 나타냅니다.(염 유도성 키나제 1)SIK1에 WNT/-카테닌 경로가 필요했음을 강력하게 보여주는 녹다운(염 유도성 키나제 1)AA에 의해 유도된 매개된 HK2 세포 손상.
그림 7 WNT/-카테닌 경로는 AA에 의해 유도된 SIK1 매개 HK2 세포 손상에 필요합니다.HK{0}} 세포를 SIK1 및 B-카테닌 shRNA로 공동 형질감염시키거나 SIK1 또는 -카테닌 shRNA 단독으로 형질감염시킨 다음 Caspase1, COL1의 72ha 실시간 PCR 분석을 위해 10 umol/L AA로 처리했습니다. E-cadherin 및 Vimentin 발현. 비. Caspase1/p20/p10, E-cadherin 및 Vimentin 발현의 Western blot 분석. 데이터는 mean±sd*P로 표시<0.05 vs=""><0.05 vs="" sik1="" shrna,=""><0.05vs β-catenin="" shrna.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
AA 유발 HK2 세포 손상에서 Twist1의 역할
EMT-TF 역할을 하는 Twistl은 EMT와 신장 섬유증을 촉진할 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 AA가 Snail과 Twist1의 단백질과 mRNA 발현을 촉진하는 반면, knockdown -catenin은 AA에 의해 유도된 Snail과 Twist1의 발현을 억제한다는 것을 발견했습니다(그림 8a). AA 유발 HK2 세포 손상에서의 역할. 우리의 가설을 검증하기 위해 우리는 siRNA(추가 파일 7)에 의해 Twist1을 녹다운하고 실시간 PCR 및 웨스턴 블롯 분석을 수행했습니다. 예상대로, AA 단독으로 자극된 대조군 세포와 비교할 때 Vimentin 및 COLI의 발현은 감소한 반면 AA 존재 하에서 Twist1 siRNA 세포에서는 ZO{12}}가 증가하여 Twist1의 침묵이 EMT의 발생을 완화함을 시사함 및 AA에 의해 유도된 신장 섬유증의 진행(도 8b 및 c).
그림 8 AA 유도 HK2 세포 손상에서 Twist의 역할.HK2 세포에서 Snail 및 Twist1 수준의 웨스턴 블롯 및 실시간 PCR 분석. b Twist1 siRNA 또는 NC siRNA.c로 처리된 HK2 세포에서 Twist1, COL1, ZO{6}} 및 Vimentin 수준의 실시간 PCR 분석. Twist1 siRNA 또는 NC siRNA로 처리한 HK2 세포에서 Twist1, ZO{10}} 및 vimentin 수준의 웨스턴 블롯 분석 데이터는 mean±sd*P로 표시됩니다.<0.05 ys="" control.=""><0.05 ys="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
