ABSTRACT

배경:bis resorcinol은 Heliciopsis 말단 줄기(Proteaceae)의 주성분으로 분리되었습니다. 최근 레조르시놀은 다양한 화장품에 활성 미백제로 적용되고 있다. 레조르시놀의 구조적 유사성으로 인해 노화 효소 길항제로서 비스 레조르시놀의 이점이 이 연구에서 입증되었습니다.

관련 연구에 따르면, Cistanche는 "생명을 연장하는 기적의 허브"로 알려진 일반적인 허브입니다. 주성분은 시스타노사이드(cistanoside)로 항산화, 항염증, 면역기능 촉진 등 다양한 효능이 있다. cistanche와 피부 미백 사이의 메커니즘은 citanche glycosides의 항산화 효과에 있습니다. 인간 피부의 멜라닌은 티로시나제에 의해 촉매되는 티로신의 산화에 의해 생성되며, 산화 반응에는 산소의 참여가 필요하므로 체내의 산소가 없는 라디칼이 멜라닌 생성에 영향을 미치는 중요한 요인이 됩니다. Cistanche는 산화 방지제인 cistanoside를 함유하고 있으며 신체의 자유 라디칼 생성을 감소시켜 멜라닌 ​​생성을 억제할 수 있습니다.

미백을 위한 Cistanche Tubulosa 클릭

더 많은 정보를 위해서:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

행동 양식:비스 레조르시놀은 각각 용매 추출 및 예비 크로마토그래피에 의해 H. 말단 줄기의 조 에탄올 추출물로부터 정제되었다. 화합물의 콜라게나제, 엘라스타제 및 티로시나제에 대한 억제 활성을 다른 분광기법을 사용하여 조사하였다. 효소 활성 부위 주변 물질의 가능한 상호 작용을 예측하기 위해 분자 도킹을 수행했습니다.

결과:bis resorcinol 및 caffeic acid의 콜라게나아제에 대한 IC50 값은 각각 156.7 ± 0.7 및 308.9 ± 1.6 μmole L-1이었습니다. 엘라스타제 활성에 대해, 비스 레조르시놀 및 우르솔산에 대해 각각 33.2 ± 0.5 및 34.3 ± 0.3 μmole L-1의 IC50이 측정되었다. bis resorcinol은 22.8 μmole L-1의 IC50을 나타내어 tyrosinase를 억제하였고 α-arbutin에 대해서는 78.4 μmole L-1을 나타냈다. 비스 레조르시놀은 -5.89, -5.69 및 -6.57 kcal mol-1의 각각의 결합 에너지로 콜라게나제, 엘라스타제 및 티로시나제에 결합하였다. 이러한 결합 에너지는 테스트된 억제제와 동일한 범위에 있었습니다. 구조의 방향족 페놀 그룹은 효소와의 결합 상호 작용을 지원할 뿐만 아니라 원리를 담당했습니다. 하이드록실 그룹으로 인한 수소 결합 및 방향족 고리(들)로부터의 π 관련 인력은 비스 레조르시놀에 결합 다양성을 제공했습니다.

결론:H. 말단에서 정제된 비스 레조르시놀은 노화 효소 길항제로서 화장품에 포함시키는 데 유용할 수 있습니다.

과목 생화학, 생물 정보학, 세포 생물학, 피부과, 데이터 마이닝 및 기계 학습

키워드Heliciopsis terminals, Bisresorcinol, Collagenase, Elastase, Tyrosinase, 항노화성, 분자 도킹, 효소억제

소개

A 비스 레조르시놀, (8'Z)-3,5-디하이드록시-1-[16'-(3″,5″-디하이드록시페닐)-8'-헥사데센{{ 11}}'-yl] benzene은 Proteaceae과의 식물인 Heliciopsis terminals(Kurz) Sleumer의 줄기에서 풍부한 성분으로 분리되어 베트남의 소수 민족들이 간 보호 효과를 위해 사용했습니다. 현재까지 항염증제, 말론디알데히드(MDA) 생성 억제 및 간 보호제로서의 이 화합물의 의학적 이점은 시험관 내 및 생체 내에서 명확히 밝혀졌습니다(Giang et al., 2019). 비스 레조르시놀의 분자는 메타-C7H14C=CC7H14 결합으로 함께 결합된 2개의 레조르시놀 분자(EC No 203-585-2)를 포함한다는 점에서 명백합니다(그림 1A). 레조르시놀은 최근 화이트테라피용 페이셜 농축 세럼 형태로 적용되고 있다. 소비자 안전 과학 위원회(벨기에 브뤼셀)(SCCS 1270/09, 유럽 위원회, 소비자 안전 과학 위원회, 2010)에 따라 레조르시놀은 최대 1.25%의 농도 범위에서 속눈썹을 염색하기 위한 제품의 산화제로 규제되었습니다. , 또는 농도 범위가 최대 0.5%인 헤어 로션 및 샴푸. 따라서 레조르시놀의 미용 용도는 다양합니다. 미백제의 경우, 표피의 기저 세포층에 상주하는 멜라닌 세포에 의한 멜라닌 합성의 억제가 추정된다. 티로시나제(EC 1.14.18.1)는 L-티로신이 기질로 사용되는 멜라닌 생성을 촉매하는 핵심 효소입니다. 멜라닌은 자외선으로 인한 손상으로부터 피부를 보호하는 데 도움이 되지만 과도한 멜라닌 생성은 과색소침착, 주근깨, 검버섯을 유발할 수 있습니다. 레조르시놀 외에도 독특한 화학 구조를 가진 다양한 합성 및 천연 화합물이 항티로시나제 활성을 나타내는 것으로 입증되었습니다(Dobos et al., 2015).

자외선은 피부노화를 일으키는 주요 외부요인이다. 대신 피부는 UV 노출 후 내부에서 생성되는 반응성 산소종(ROS)과 지질 과산화물에 의해 시간이 지남에 따라 노화될 수 있습니다. 과산화지질 대사의 이차 생성물은 세포외 기질(ECM)의 엘라스틴 및 콜라겐 섬유를 손상시킬 수 있습니다. 따라서 자외선에 노출되면 탈수, 탄력 저하, 피부 주름 등이 생길 수 있다. 우리가 아는 한, ECM은 만료된 조직 단백질이 콜라게나아제와 같은 매트릭스 금속단백분해효소 및 엘라스타아제와 같은 세린 프로테아제에 의해 적절하게 분해되는 것과 함께 정상 조직 구조를 유지하기 위해 주기적으로 리모델링됩니다(Thring, Hili & Naughton, 2009). 또한 산화 스트레스에 의해 노화 효소의 양과 활성이 모두 증가하여 광범위한 ECM 분해와 진행성 노화로 이어집니다(Sherratt et al., 2019). 따라서 금속 이온과 복합체를 형성할 수 있는 화합물은 이에 따라 콜라게나제, 엘라스타제 및 티로시나제를 억제할 것으로 예상된다(Selvaraj et al., 2014). 이 프로젝트는 in vitro에서 티로시나제, 콜라게나제 및 엘라스타제에 대한 비스 레조르시놀의 생물학적 효과를 확인하는 것을 목표로 하며, 도킹 기술을 수행하여 분자 수준에서 이들의 상호 작용을 명확히 했습니다. 비스 레조르시놀로 노화 과정을 지연시키고 피부 외관을 개선할 수 있기를 바랍니다.

재료 및 방법

화학물질 및 기구

화합물 정제, 식별 및 비준

H. 말단 트렁크의 에탄올 조 추출물은 바우처 표본 번호 HNIP-18473로 베트남 국립 대학교 화학과 PM Giang 교수로부터 관대하게 얻었습니다. 그 후, 3회 반복하여 메탄올/n-헥산으로 분할하였다. 메탄올 층을 증발시켜 거의 건조시킨 후 에틸 아세테이트/1-부탄에 분배하였다. 에틸 아세테이트 층은 그 부피가 80%까지 감소될 때까지 기화되었다. 생성된 점성 액체를 다음과 같이 클로로포름/메탄올 구배 용출을 사용하여 실리카 겔 컬럼에서 정제했습니다: 100% 클로로포름, 30:1, 20:1, 10:1, 7:1, 5:1, 3:1, 3 :2, 2:1 클로로포름/메탄올, 100% 메탄올. 5:1 혼합 용매의 용리액을 모아 1/4 부피로 증발시킨 후 메탄올과 아세톤의 기울기 용출을 사용하여 ODS 컬럼에서 분리하였다. 원하는 화합물, 즉 bis resorcinol(그림 1)은 70% 아세톤을 포함하는 용리액에서 얻었고 기기 라이브러리 데이터와 관련하여 MS, NMR 및 IR 분광법으로 확인했습니다. 순도 추정을 위해 박층 크로마토그래피를 사용하였다.

생물학적 활동 분석

시험관 내에서, 비스 레조르시놀 및 공지된 억제제에 대한 콜라게나제, 엘라스타제 및 티로시나제에 대한 효소 억제 분석으로 구성된 실험을 다음과 같이 수행하였다.

콜라게나제 억제

최근의 항콜라게나제 분석은 이전에 Widyowati et al. (2016). 요컨대, 400mmol L-1 NaCl 및 10mmol L-1 CaCl2가 보충된 50mmol L-1 트리신 버퍼 pH 7.5를 완충 희석제로 사용했습니다. Clostridium histolyticum(EC.3.4.24.3)의 콜라게나아제를 완충액에 1 mg L-1의 농도로 용해했습니다. 효소-기질 MOCAc-PRO-Leu-Gly-Leu-A2pr (Dnp)-Ala-Arg-NH2를 먼저 DMSO에 용해한 다음 완충액에서 1mmol L-1의 농도로 희석했습니다. DMSO에 녹인 시료는 완충액을 이용하여 농도별로 희석하였다. 2-µl 시료 용액을 100µl 효소 용액과 함께 37℃에서 10분 동안 배양했습니다. 그런 다음 50-µl 기질을 추가하고 완전히 혼합했습니다. 405nm에서 형광 방출(F)을 즉시 기록하고 여기를 위해 320nm의 파장을 사용하여 30분 동안 지속적으로 모니터링했습니다. Caffeic acid는 위치 제어로 사용되었습니다(그림 1). 음성 대조군은 물로 수행하였다. 퍼센트 억제(퍼센트)는 하기 방정식으로부터 계산되었다:

퍼센트 억제 {{0}}{1 - (Fsam; 30 - Fsam; 0)÷(Fcont; 30 - Fcont; 0)} ×100.

엘라스타제 억제

Abhijit & Manjushree(2010)에 따른 분석을 일부 수정하여 적용했습니다. 간략하게, 버퍼 시스템은 0.2mM Tris-HCl 버퍼(pH 8.0)였습니다. 1 µg mL-1 돼지 췌장 엘라스타제(EC.3.4.21.36) 용액을 멸균수에 준비했습니다. 효소 기질인 N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide(SANA)는 완충액에 80mmol L-1의 농도로 용해되었습니다. DMSO에 녹인 시료는 완충액을 이용하여 다양한 농도로 희석하였다. 100-µl 시료 용액을 50µl 효소 용액과 혼합하고 15분 동안 배양했습니다. 그 후 50 ㎕의 효소-기질 용액을 첨가하고 완전히 혼합하였다. OD410은 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 즉시(0분), 37도에서 밤새(o/n) 배양한 후 측정되었습니다. Ursolic acid는 양성 대조군으로 사용되었으며(그림 1), 물은 음성 대조군으로 사용되었습니다. 억제 백분율(퍼센트)은 다음 방정식으로 계산되었습니다.

퍼센트 억제 {{0}} {1 - [(Asam; o/n - Asam; 0)÷(Acont; o/n - Acont; 0)]} ×100:

티로시나제 억제

사용된 티로시나아제 억제 분석은 이전에 설명한 방법(Jiratchayamaethasakul et al., 2020)에서 채택되었습니다. 간단히 말해서, 분석은 0.05 mol L-1 인산염 완충액 pH 6.8에서 수행되었습니다. 버섯 티로시나제(EC.1.14.18.1)를 100 단위 mL-1의 농도로 완충액에 용해시켰다. 효소 기질인 L-티로신은 완충액에 0.25 mg/mL 농도로 준비되었다. DMSO에 용해된 테스트 화합물을 0.625~10mg/mL 범위의 농도로 희석했습니다. 96-웰 플레이트의 웰에 10 μl 샘플과 40 μl L-티로신 용액을 혼합하고 실온에서 10분 동안 배양했습니다. 그 후 50 ㎕의 효소 용액을 접종하고 완전히 혼합하였다. 그 후 얼음 위에서 1분 동안 배양하여 반응을 중단했습니다. OD475는 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정되었습니다. -알부틴과 물은 각각 양성 대조군(그림 1)과 음성 대조군으로 사용되었습니다. 억제 백분율(퍼센트)은 다음과 같은 방정식으로 계산되었습니다.

분자 도킹 연구

리간드 및 수용체의 준비

bis resorcinol(CID 8917124)의 3차원(3D) 구조와 기질 및 억제제를 포함한 기준 화합물을 분자 도킹 연구를 위해 PubChem 데이터베이스에서 다운로드했습니다. Online SMILES Translator 및 Structure File Generator를 사용하여 PDB(Protein Data Bank) 형식 파일로 리간드 구조를 준비했습니다. 콜라게나아제(PDB ID 2Y6I), 엘라스타아제(PDB ID 1BRU), 티로시나아제(PDB ID 2Y9X)와 같은 효소의 결정 구조는 RCSB 단백질 데이터베이스에서 얻었다. 물과 부착된 분자는 선택된 모든 단백질 구조에서 해부되었습니다. 한편, AutoDockTools 1.5.6에 의해 결정화된 단백질 구조에 극성 수소 원자가 추가되었습니다. 표적 단백질 및 기타 사용된 화합물의 파일은 분자 도킹을 수행하기 전에 PDBQT 형식으로 저장되었습니다.

활성 부위 잔기의 선택 및 분자 도킹

활성 사이트 예측의 그리드 및 도킹 프로토콜은 AutoDockTools 1.5.6을 사용하여 준비되었습니다. 그리드 사이트는 0.375Å의 간격으로 설정되었습니다. xyz 치수는 콜라게나아제의 경우 126-135-160 Å3, 엘라스타아제의 경우 130-120-126 Å3, 티로시나아제의 경우 80-80-80 Å3으로 설정되었습니다. 격자 상자 중심(AutoDockTools의 오프셋 값 포함)은 31.869 (5.000), −19.41(−25.{{20}}), 콜라게나아제의 경우 17.815였습니다. , 30.048(−0.972), 51.253(−2.722), 엘라스타제의 경우 17.6, 및 −8.407(−1.000), −23.795(−0.250), −36.019(−3.500 ) 각각 티로시나제에 대해. 리간드 화합물이 유연한 분자로 설정되는 동안 단백질 구조는 단단한 실체로 사용되었습니다. 도킹 연구는 AutoDock4 버전 4.2에 의해 구현된 Lamarckian 유전 알고리즘(GA)을 사용하여 수행되었습니다. GA 실행 수는 50회이고 인기 있는 크기는 200회입니다. 결합 에너지(ΔGbind)는 ADT로 분석했습니다. BIOVIA Discovery Studio(BIOVIA, 2020)를 사용하여 상호 작용을 시각화했습니다. 화합물과 단백질 수용체 사이의 분자 상호 작용은 BIOVIA Discovery Studio 소프트웨어(BIOVIA, 2020)를 사용하여 분석 및 시각화되었습니다. 단백질 결합 부위 화합물의 구조는 VMD(Visual Molecular Dynamics) 패키지를 사용하여 가시화되었다(Humphrey, Dalke & Schulten, 1996).

통계 분석

결과

H. terminals' trunk로부터 각각 용매추출법과 역상 HPLC법을 이용하여 주요 성분을 성공적으로 정제하였다. 획득한 1 H-NMR 및 13C-NMR 스펙트럼을 SciFinder(https://scififinder.cas.org/)를 통해 기준 물질과 비교하여 (8′Z)-1,{ {6}}디하이드록시-5- [16'-(3″,5″-디하이드록시페닐)-8'-헥사데센-1'-일] 벤젠(Chaturvedula et al., 2{{ 23}}02). 그것은 bisresorcinols의 하나로 분류되었습니다. 이 최근의 비스 레조르시놀은 분자량이 463.2819 달톤인 C28H40O4의 분자식을 가졌다. 추출 수율은 줄기의 건조 중량을 기준으로 0.086%로 계산되었습니다. 획득한 1H 및 13C-NMR 스펙트럼과 관련하여 그 순도는 98% 이상이었습니다(그림 S1 및 S2 참조).

체외 생물 활성 분석

콜라게나제, 엘라스타제 및 티로시나제와 같은 노화 효소에 대한 비레조르시놀의 길항 효과는 별개의 분광법을 사용하여 시험관 내에서 결정되었습니다. 결과는 표 1과 그림 2에 요약되어 있습니다. 콜라게나아제 억제를 위해 MOCAc-PRO-Leu-Gly-Leu-A2pr (Dnp)-Ala Arg-NH2 효소 기질 및 효소 억제제로서의 카페산. 156.7 μmol L-1 농도의 비스레조르시놀은 효소 활성을 50%(IC50) 감소시키는 것으로 나타났습니다. 대신, 카페산의 IC50은 308.9 ± 13.7 µmol L-1이었습니다. 따라서, 비스레조르시놀의 항콜라게나제 활성은 카페산보다 훨씬 더 강했다.

자세한 정보: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501