RNA 염기서열 분석을 기반으로 신장 노화에 대한 LncRNA의 역할 예측 Ⅱ

lncRNA Gm43360과 잠재적 표적 mRNA의 상관 관계

LncRNA Gm43360은 두 개의 lncRNA-mRNA 동시 발현 네트워크를 연결했기 때문에 연구를 위해 선택되었습니다. Adra1a의 발현 수준은 Gm43360의 발현 수준과 양의 상관관계(rho=0.8650, p=0.026)를 나타냈고, Csnk1a1(카제인 키나제 1A1)은 음의 상관관계(rho{{12)를 나타냈습니다. }}.8084, p=0.0084)(그림 5a). lncRNA Gm43360과 잠재적인 표적 mRNA인 Adra1a 및 Csnk1a1의 상관관계를 추가로 검증하기 위해 본 연구에서는 lncRNA Gm43360의 과발현 플라스미드를 설계했습니다. Csnk1a1의 발현은 예상대로 감소했고, Adra1a 발현도 감소했지만 크게 감소하지는 않았습니다. 다음으로 우리는 siRNA로 lncRNA Gm43360을 녹다운하여 표적 mRNA의 발현이 영향을 받는지 여부를 확인했습니다. 예상대로 Csnk1a1은 siRNA 음성 대조군에 비해 lncRNA Gm43360 녹다운 세포에서 증가했습니다 (그림 5b). 10, 우리는 세포주기에서 lncRNA Gm43360의 역할을 발견했습니다. 세포 계수 키트-8(CCK-8) 결과는 lncRNA Gm43360이 세포 생존성을 촉진하는 것으로 나타났습니다(그림 5c). 결과는 lncRNA Gm43360이 음성 대조군과 비교하여 S 상 세포의 비율을 증가시키고 G1 상 세포의 비율을 감소시키는 것으로 나타났습니다 (그림 5d). Te p53과 p21 단백질은 세포주기 조절에 관여하여 세포 노화의 지표였습니다. p53과 p21의 발현 수준은 대조군에 비해 과발현군에서 유의하게 감소하였다. p53과 p21의 발현 수준은 siRNA 대조군에 비해 siRNA 군에서 유의하게 증가했습니다 (그림 5e). lncRNA Gm43360의 과발현은 SA{46}}gal 양성 세포의 수를 감소시켰고, transfect한 Gm43360 그룹에서 -gal 양성 세포의 수를 증가시켰습니다(그림 5f). 종합하면, 이러한 결과는 lncRNA Gm43360이 신장 세뇨관 상피 세포의 노화를 다음과 같이 억제한다는 것을 나타냅니다.Csnk1a1의 발현 억제.

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논의

본 연구에서는 젊은 쥐와 늙은 쥐 신장의 mRNA 발현 데이터를 평가하고, 비정상적으로 발현된 mRNA의 기능을 밝히는 생체 정보 분석을 수행했습니다. 우리는 347개의 상향 조절된 mRNA와 355개의 하향 조절된 mRNA뿐만 아니라 130개의 상향 조절된 lncRNA와 91개의 하향 조절된 lncRNA를 관찰했습니다.늙은 쥐의 신장과 어린 쥐의 신장 비교. 또한, 이러한 mRNA는 다음과 같은 노화 관련 경로에 관여하는 것으로 나타났습니다.산화적 인산화, AMPK 신호 전달 경로, Wnt 신호 전달 경로, Rap1 신호 전달 경로 및 연령 관련 질병은 신장 노화의 발병 기전에서 차별적으로 발현되는 mRNA의 기능을 입증합니다.

긴 비암호화 RNA NEAT1은 신세뇨관 상피 세포에서 신장 섬유증 진행의 보호 인자입니다[21]. 우연히도 우리의 시퀀싱 결과에서 lncRNA NEAT1은 어린 쥐보다 나이 든 쥐의 신장에서 더 낮은 수준으로 발현되었으며 이는 이전 연구 결과와 일치합니다. LincRNA-Gm4419는 당뇨병성 신장병증에서 NF-kB/NLRP3 염증복합체 매개 메커니즘을 통해 염증 및 섬유증을 가속화합니다[22]. 우리의 시퀀싱 결과에서 우리는 Gm4419의 발현이 어린 쥐보다 나이 든 쥐의 신장에서 더 높았지만 유의미한 차이는 없음을 발견했습니다. LncRNA Gm43360은 염색체 5(Chr5:122494022–122,494,908, 2887bp)에 위치합니다. UCSC Genome Browser에 따르면 Gm43360은 단백질 코딩 유전자 Atp2a2의 인트론에 위치합니다. 그러나 현재까지 lncRNA Gm43360이 질병에 관여한다는 보고는 없습니다. 이 연구에서 lncRNA Gm43360의 녹다운은 신장 세뇨관 상피 세포 노화를 촉진했습니다. 또한, 우리는 시퀀싱 결과에서 차별적으로 발현되는 많은 lncRNA를 확인하고 조사했습니다.

LncRNA는 lncRNA 조절 메커니즘에 따라 cis-regulation과 trans-regulation으로 분류되었습니다. cis-작용 lncRNA는 lncRNA와 mRNA 사이의 거리가 100kb 미만인 프로모터, 인핸서 및 조절 서열과 같은 cis-작용 요소에 따라 이웃 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있습니다. Trans-acting lncRNA는 transfection 부위를 떠나 먼 부위에서 작동하는 lncRNA를 의미합니다(즉, lncRNA와 mRNA 사이의 거리가 100kb 이상입니다)[23]. lncRNA MAAT는 cis-조절 모듈을 통해 이웃 유전자 Mbnl1의 발현을 증가시킵니다. lncRNA Pnky는 피질 발달에서 trans-acting Regulator 역할을 합니다. 이 연구에서는 lncRNA Gm43360과 Csnk1a1 사이에 규제 간 관계가 있었습니다. Csnk1a1은 세포 주기와 세포 분열 과정에 참여하는 단백질을 코딩하는 종양 억제 유전자[26]입니다. Csnk1a1 하향 조절은노화 관련 염증성대장 종양의 성장 정지에 대한 반응 [26]. Gm43360이 상향 조절될 때 Csnk1a1이 하향 조절되었습니다. 따라서 lncRNA Gm43360이 참여할 가능성이 높습니다.신장 노화~에 의해Csnk1a1 발현 조절.

결론

lncRNA-mRNA 동시 발현 네트워크에 대한 우리의 조사신장 노화lncRNA인 lncRNA Gm43360이 신장 노화에 보호 역할을 할 수 있음을 밝혀냈고 신장 노화와 관련된 메커니즘에 대한 이해를 넓혔습니다.신장 노화

재료 및 방법

샘플 젊은(3-개월) 및 늙은(24-개월) 수컷 C57BL/6J 마우스를 Xiamen University의 실험 동물 센터에서 구입하여 표준 환경에서 사육했습니다. 모든 쥐는 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었습니다. 생쥐를 희생시키기 전 한 달 동안 새로운 시설에 적응시켰습니다. 검체 채취 전 750 mg/kg 용량의 우레탄을 복강 내 주사하여 마우스를 마취시켰습니다. 어린 생쥐와 늙은 생쥐를 같은 날 희생시켰습니다.잔여 마우스 신장조직은 각 분석에서 시퀀싱에 사용되었습니다. RNA-seq 및 조직병리학이 수행되었습니다.별도의 신장같은 마우스에서. 신장 조직은 생쥐로부터 수집되었습니다. 한쪽 신장은 후속 절편 삽입을 위해 즉시 10% 중성 완충 포르말린에 담그고, 다른 쪽 신장은 여러 조직으로 나누어 즉시 액체 질소에 넣은 후 -80도에서 보관했습니다. 이 연구는 시안교통대학(중국 산시) 제1부속병원 윤리위원회(No. 2018-G-164)의 지원을 받았습니다. 모든 방법은 동물 윤리 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다. 본 연구는 ARRIVE 가이드라인을 준수하여 수행되었습니다.

신장 조직병리학

어린 쥐와 늙은 쥐의 신장 조직 샘플을 10% 파라포름알데히드 용액에 밤새 고정시켰습니다. 절편 중 10개는 탈수되고 파라핀 포매되었으며 4-μm 두께로 절편되었습니다. PAS 및 Masson의 삼색성 염색은 표준 프로토콜을 사용하여 수행되었습니다. 이미지를 카메라로 촬영하고 염색 양성 영역을 측정했습니다. 조직병리학 카메라 이미지의 영역은 Image-Pro Plus 6.0을 사용하여 계산되었습니다.

SA‑ ‑gal 염색

SA{0}}gal 활동은 SA- -gal 염색 키트(Cell Signaling Technology #9860)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 분석되었습니다. 양성 염색 면적을 측정하고 Image-Pro Plus 6.0을 사용하여 SA{3}}gal 양성 세포를 계산했습니다.

RNA 추출 라이브러리 구축 및 시퀀싱

Samples (each 5 mice in young and old mice) were used for lncRNA and mRNA expression analyses. Young mice were numbered 3M1, 3M2, 3M3, 3M4, and 3M5, and old mice were numbered 24M1, 24M2, 24M3, 24M4, and 24M5. Total RNA was extracted using Trizol reagent (thermofsher, 15,596,018) following the manufacturer's instruction. The total RNA quantity and purity were analyzed of Bioanalyzer 2100 and RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent, CA, USA, 5067−1511), and high-quality RNA samples with RIN number>7.0은 시퀀싱 라이브러리를 구성하는 데 사용되었습니다. 총 RNA를 추출한 후 Dynabeads Oligo(dT)(Thermo Fisher, CA, USA)를 사용하여 총 RNA(5ug)로부터 mRNA를 2회 정제하여 정제했습니다. 정제 후, mRNA는 고온에서 2가 양이온을 사용하여 짧은 단편으로 분할되었습니다(94도 5-7분 하에서 마그네슘 RNA 단편화 모듈(NEB, cat. e6150, USA)). 그런 다음 절단된 RNA 단편을 역전사하여 SuperScript™ II 역전사효소(Invitrogen, cat. 1,896,649, USA)를 사용하여 cDNA를 얻었고, 이는 다음으로 E. coli DNA 중합효소 I을 사용하여 U-표지된 두 번째 가닥 DNA를 합성하는 데 사용되었습니다. NEB, cat.m0209, 미국), RNase H(NEB, cat.m0297, 미국) 및 dUTP 솔루션(Termo Fisher, cat.R0133, 미국). 그런 다음 A-염기를 각 가닥의 무딘 말단에 추가하여 인덱싱된 어댑터에 연결하기 위해 준비했습니다. 각 어댑터에는 어댑터를 A-꼬리 단편화된 DNA에 연결하기 위한 T-베이스 돌출부가 포함되어 있습니다. 이중 인덱스 어댑터를 단편에 연결하고 AMPureXP 비드를 사용하여 크기 선택을 수행했습니다. U-표지된 두 번째 가닥 DNA에 열에 불안정한 UDG 효소(NEB, cat.m0280, USA)를 처리한 후, 라이게이션된 생성물을 다음 조건에 따라 PCR로 증폭시켰다: 95도에서 3분 동안 초기 변성; 15초 동안 98도에서 변성, 15초 동안 60도에서 어닐링, 30초 동안 72도에서 확장의 8주기; 그런 다음 72도에서 5분 동안 최종 확장합니다. 최종 cDNA 라이브러리의 평균 삽입 길이는 300±50bp였습니다. 마지막으로 제조업체의 프로토콜에 따라 Illumina Novaseq™ 6000(LC-Bio Technology CO., Ltd., Hangzhou, China)에서 2×150bp 쌍방향 시퀀싱(PE150)을 수행했습니다.

생물정보학 분석 Clean Read의 순서 및 필터링

풀링된 RNA로부터 기술로 구축된 cDNA 라이브러리신장 샘플쥐의 서열을 분석하고 Illumina NovaseqTM 6000 서열 플랫폼을 사용하여 실행했습니다. Illumina의 쌍방향 RNA-seq 접근 방식을 사용하여 전사체의 서열을 분석하여 총 100만 개의 2×150bp 쌍방향 읽기를 생성했습니다. 시퀀싱 기계에서 얻은 판독에는 다음 조립 및 분석에 영향을 미치는 어댑터 또는 낮은 품질의 베이스가 포함된 원시 판독이 포함됩니다. 따라서 고품질의 깨끗한 읽기를 얻기 위해 읽기는 Cutadapt [29](https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/, version:cutadapt-1.9)에 의해 추가로 필터링되었습니다. 매개변수는 다음과 같습니다:

1) 어댑터가 포함된 읽기를 제거합니다.

2) 폴리A 및 폴리가 포함된 판독값을 제거합니다.

3) 미지의 뉴클레오티드(N)가 5% 이상 포함된 리드를 제거하는 단계;

4) 저품질(Q-값 20 이하) 염기가 20% 이상 포함된 저품질 판독을 제거합니다.

FastQC [3{1}}] (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/, 0.11.9)를 사용하여 10가지 서열 품질을 검증했습니다. 깨끗한 데이터의 Q20, Q30 및 GC 내용을 포함합니다. 그 후, 총 G bp의 정리된 페어드 엔드 읽기가 생성되었습니다. 원시 서열 데이터는 수탁 번호 GSE154223으로 NCBI Gene Expression Omnibus(GEO) 데이터세트에 제출되었습니다.

참조 게놈/주석은 Mus_musculus.GRCm38이었습니다. 분석에 사용된 유전자 주석의 소스와 버전은 Ensembl_v88이었습니다.

성적표 조립

첫째, Cutadapt [29]는 어댑터 오염, 낮은 품질의 염기 및 결정되지 않은 염기가 포함된 판독값을 제거하는 데 사용되었습니다. FastQC(http://www.bioinformatics.Babra ham.ac.uk/projects/fastqc/)를 사용하여 10개의 시퀀스 품질이 매우 향상되었습니다. 우리는 Bowtie2[31]와 Hisat2[32]를 사용하여 읽기를 마우스 게놈에 매핑했습니다. 각 샘플의 매핑된 읽기는 StringTie[33]를 사용하여 조립되었습니다. 10, 모든 성적표는신장 샘플Perl 스크립트를 사용하여 포괄적인 전사체를 재구성하기 위해 병합되었습니다. 최종 전사체가 생성된 후 StringTie[33]와 edgeR[34]을 사용하여 모든 전사체의 발현 수준을 추정했습니다.

LncRNA 식별

우선, 알려진 mRNA와 겹치는 전사체와 200bp보다 짧은 전사체는 폐기되었습니다. 그런 다음 CPC[35]와 CNCI[36]를 활용하여 코딩 가능성이 있는 성적표를 예측했습니다. CPC 점수가 포함된 모든 성적표<-1 and CNCI score<0 were removed. The remaining transcripts were considered as lncRNAs.

차별적으로 발현된 분석 유전자(DGE) 분석

StringTie [33] was used to perform expression levels for mRNAs and lncRNAs by calculating FPKM [37]. Genes differential expression analysis was performed by DESeq2 software between two different groups (and by edgeR between two samples) [34, 38]. The genes with the parameter of q value below 0.6 and absolute fold change>2개는 차등적으로 발현된 유전자로 간주되었다.

lncRNA의 표적 유전자 예측 및 기능 분석

lncRNA의 기능을 탐색하기 위해 우리는 lncRNA의 cis-target 유전자를 예측했습니다. LncRNA는 이웃한 표적 유전자에 작용하는 데 cis 역할을 할 수 있습니다. 본 연구에서는 Perl 스크립트를 통해 100,000 업스트림 및 다운스트림의 코딩 유전자를 선택했습니다. 그런 다음 BLAST2GO [39] 스크립트를 사용하여 lncRNA에 대한 표적 유전자의 기능 분석을 보여주었습니다. 공개 도메인에 대한 전체 명령 링크는 main · dandan-li/Jie-Li(github.com)에 있는 Jie-Li/README.md입니다.

유전자 온톨로지(GO) 카테고리 및 교토 유전자 및 게놈 백과사전(KEGG) 분석

RNA 시퀀싱을 위한 생물정보학 분석은 OmicStudio 도구(//www.omicsudio.cn/tool)를 사용하여 수행되었습니다. Gene Ontology(GO) 기능적 농축 분석과 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) [37-39] 농축 분석을 사용하여 예측된 표적 유전자의 생물학적 기능을 분석했습니다. GO 분석은 세포 구성, 분자 기능 및 생물학적 과정(http://www.geneontology.org/)의 세 가지 측면을 통해 주요 생물학적 과정을 명확하게 합니다. 분석에서는 먼저 차별적으로 발현된 모든 유전자와 배경 유전자를 GO 데이터베이스에 넣습니다. 각 항목을 매핑하고 각 항목의 유전자 수를 계산한 후 초기하 분포를 이용하여 가설 검정을 수행하여 농축 결과의 P 값을 얻습니다. P 값이 낮을수록 농축 결과가 더 중요합니다. KEGG는 차등적으로 발현되는 mRNA를 유전생물학으로 분석하여 표적 유전자와 관련된 중요한 경로를 탐색하는 데이터베이스 리소스입니다(https://www.genome.jp/kegg/). 결과는 p-값으로 표현됩니다. p-값이 낮을수록 농축 결과가 더 중요합니다.

qRT-PCR

GAPDH는 내인성 대조군으로 사용되었습니다. 그런 다음 알려지지 않은 유전자의 상대적인 발현 수준을 계산했습니다. 모든 프라이머는 이 실험을 위해 특별히 설계되고 합성되었습니다. GAPDH용 프라이머가 상용화되었습니다. Adra1a 및 Csnk1a1 프라이머의 특이성은 용융 곡선의 단일 피크로 확인되었습니다.

mRNA-lncRNA 동시발현 네트워크 구축

Transregulation은 연구를 기반으로 한 다음 Trans 에너지를 계산했습니다. 트랜스에너지가 작을수록 결합 가능성이 높았다. 그런 다음 mRNA-lncRNA의 상관 계수도 계산되었습니다. mRNA-lncRNA 네트워크는 0.9를 초과하는 Spearman 상관 계수를 선택하여 구성되었습니다. mRNA-lncRNA 동시발현 네트워크는 Cytoscape 소프트웨어(v3.7.1)를 사용하여 구축되었습니다.

세포 배양

마우스 신장 근위 세뇨관 상피 세포(MRPT-EpiCs)를 2% 소 태아 혈청(FBS, Cat. #0010)과 상피 세포 성장 보충제-동물을 함유하는 상피 세포 배지-동물(EpiCM-a, Cat. #4131)에서 배양했습니다. (EpiCGS-a, Cat. #4182) 37도 및 5% CO2의 가습 인큐베이터에서 항생제 없이. 배양배지는 2~3일에 한번씩 갈아주었다. 대수 성장기의 세포는 성장이 90%에 도달했을 때 계대배양하였다. 트립신에 의해 소화된 세포 현탁액을 각 웰에 2*104 -5*104개의 세포가 있는 6-웰 플레이트에 접종했습니다. 형질감염에 사용된 세포는 모두 2세대에서 5세대 사이의 세포였습니다.

플라스미드 구축 및 세포 형질 감염

lncRNA Gm43360 과발현 플라스미드는 GeneChem(중국 상하이)에 의해 제작되었습니다. 플라스미드 백본은 GV658이었고 CMV 프로모터는 lncRNA 발현을 유도했습니다. 복제된 뉴클레오티드 서열은 보충 자료로 제공됩니다. lncRNA Gm43360 녹다운의 경우, 3개의 lncRNA ENS가00000197656-siRNA를 표적으로 삼아야 합니다(lncRNA Gm43360- siRNA1, 5'-CCUUCACUCCAGCUGGUAATT-3'; lncRNA Gm43360-siRNA2, 5'-CCCUGUCACUCA UGAAGUUTT-3'; 및 lncRNA Gm43360-siRNA3, 5'-GGUCAAAUAACUCAAUGGGTT-3')은 GenePharma(중국 상하이)에서 설계하고 합성했습니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 세포를 웰당 6μl의 Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent(Invitrogen, USA)와 함께 2500ng의 플라스미드 또는 100pmol의 siRNA로 형질감염시켰습니다. RNA 및 단백질 발현 수준은 형질감염 후 48시간에 검출되었으며, 각 실험은 최소 3회 반복되었습니다. lncRNA Gm43360 과발현 및 녹다운의 효율성을 검증하기 위해 실시간 정량 PCR이 사용되었습니다.

웨스턴 블롯 분석

배양된 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 세척하고 RIPA 완충액(Heart, China) 120μl를 첨가한 후 프로테아제 억제제와 PMSF(Heart, China)를 얼음 위에서 30분간 첨가하였다. 다양한 미세원심분리 튜브에 세포를 수집한 후 단백질 농도를 정량화했습니다. 각 샘플에 로딩 버퍼를 첨가한 후 7분간 끓였습니다. 30 마이크로그램의 샘플을 12% SDS-PAGE(Beyotime, China)로 분리하고 PVDF 멤브레인(Thermo Fisher, USA)으로 전기전달했습니다. 그런 다음 막을 5% 우유로 막았습니다. 막을 특정 1차 항체와 함께 배양했습니다: 항-p21(1:1000, Abcam, ab109199), 항-p53(1:1000, Proteintech, 10442-1-AP) 및 항-GAPDH(1:3000, Profintech) , 60004-1-Ig) 밤새 4도에서. TBST로 세척한 후, 막을 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 단백질 밴드는 화학발광 키트(Millipore, USA)를 사용하여 관찰하였다. GAPDH의 발현은 단백질 수준을 표준화하는 데 사용되었습니다.

세포 증식 분석

세포 증식 능력은 세포 계수 키트-8(CCK-8) 분석으로 결정되었습니다. 형질감염 48시간 후, 새로운 배지 90μl와 CCK-8 용액 10μl를 각 웰에 첨가했습니다(Beyotime, C0042). 세포를 5% CO2, 37도에서 1-4시간 동안 배양하고 범용 마이크로플레이트 판독기(Bio-Tek, USA)를 사용하여 450 nm에서 측정했습니다.

유세포 분석

형질감염 전날 세포를 6-웰 플레이트에 플레이팅했습니다. 형질감염 48시간 후, 세포를 트립신처리하고 1000rpm에서 5분간 원심분리하였다. 그런 다음, 세포를 4도에서 70% 에탄올에 적어도 4시간 동안 고정시켰다. 원심분리 후, RNase A와 propidium iodide(PI) 염색 용액을 세포에 첨가하고, 세포를 암실의 실온에서 30분간 배양하였다. Te로 염색된 세포는 ACEA NovoCyte(Biosciences, USA)를 사용하여 분석되었습니다.

통계 분석

정규분포에 의한 측정 데이터는 평균±SD로 표시됩니다. 서로 다른 두 그룹 간의 차이는 양측 unpaired Student's t-test를 사용하여 결정되었으며, p-값 <0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주했습니다. 모든 계산은 GraphPad Prism 8(GraphPad Software, Inc., USA)을 사용하여 수행되었습니다.

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