SARS-CoV-2에 대한 보호 체액 및 세포 면역 반응은 회복 후 최대 1년 동안 지속됩니다.
Apr 14, 2023
SARS-CoV-2 백신은 이 바이러스의 확산을 억제하기 위해 효과적인 인구 수준 면역을 구축하기 위해 전 세계적으로 출시되었습니다. 보호 면역의 효과와 기간은 공중 보건에 중요한 요소입니다. 여기서 우리는 204명의 SARS-CoV-2 특정 면역 반응의 동역학을 보고합니다. 1-COVID에서 회복된 후-19 최대 1-년입니다. RBD-IgG 및 전장 스파이크-IgG 농도 및 혈청 중화능은 첫 6개월 동안 감소하지만 퇴원 후 1년까지 안정적으로 유지됩니다. 회복기 초기에 높은 IgG 수치를 생성했던 개인도 1년 후에 비슷한 수준으로 감소한 IgG 수치를 보였습니다.
집단면역이란 한 사회의 많은 사람들이 예방접종이나 자연감염을 통해 특정 질병에 대한 면역을 갖게 된 사회에서 예방접종을 받지 않았거나 감염되지 않은 사람들을 효과적으로 보호하는 것을 말한다. 따라서 전염병의 확산 및 발생 가능성을 줄입니다. 일반적으로 한 사회의 인구의 70~90% 이상이 질병에 대한 면역력을 갖게 되면 그 사회의 인구면역력은 예방접종을 받지 않았거나 감염되지 않은 사람들을 보호할 수 있는 충분한 수준에 도달할 수 있다. 감염된 사람들은 질병에 면역이 있습니다.
동시에 면역력 향상도 필요하며, 이를 위해서는 건강한 식습관과 충분한 운동 등 좋은 생활습관이 필요합니다. 또한 Cistanche도 면역력을 향상시킬 수 있음을 발견했습니다. Cistanche는 항산화 물질이 풍부하여 인체의 자유 라디칼을 줄일 수 있습니다. 역할을 하여 면역력을 높여줍니다.
특히, RBD-IgG 수준은 혈청 중화능과 양의 상관관계가 있어 혈청 보호 예측에서 RBD-IgG의 대표적인 역할을 시사합니다. 더욱이 스파이크 및 핵단백질 특이성을 포함한 바이러스 특이 세포 면역 보호는 6개월에서 12개월 사이에 지속되었습니다. 전체적으로, 우리의 연구는 1년 동안 바이러스 특정 보호 면역의 지속성을 지원합니다.
중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 바이러스(SARS-CoV-2) 특정 면역 반응은 바이러스 복제 억제, 질병 심각도 완화 및 재감염 예방에 중요합니다1-4. 야생형 SARS-CoV-2 감염에서 회복된 개인은 D614G 돌연변이1에 의한 재감염으로부터 교차 보호할 수 있습니다. 등. SARS-CoV-2에 노출된 비인간 영장류는 붉은털원숭이 감염 모델에서 강력한 항체 반응을 일으키고 대부분 재감염에 면역이 있음을 입증했습니다2.
In a clinical trial testing the protective effect of neutralizing antibodies, outpatients who received neutralizing antibody therapy were less likely to have a COVID-19–related hospitalization or visit to an emergency department and were less likely to develop severe symptoms3. A two-dose regimen of BNT162b2 elicited robust immune protection against COVID-19 in persons aged >16세4. SARS-CoV-2 회복기 환자와 백신 접종자는 일반적으로 강력한 면역 반응을 생성합니다. SARSCoV-2 감염에 대한 보호 면역 반응은 체액성 면역글로빈(IgA 및 IgG)과 T 세포 반응의 두 가지 주요 부분으로 구성됩니다.
이상적인 목표는 무균 감염을 달성하는 것입니다. 따라서 대부분의 연구는 즉시 이용 가능한 보호 혈청 IgG 분석에 중점을 둡니다1,2,4,5. 강력한 T 세포 면역 보호는 바이러스 함유 세포를 표적으로 하고, 생체 내 바이러스 확산을 제한하고, 바이러스 제거를 가속화하고, 질병 부담을 완화합니다. 바이러스 특정 체액 및 T 세포 반응은 회복기 SARS-CoV-2 개인5,6에서 최대 6~8개월 동안 약간의 감소와 함께 지속될 수 있습니다. 보호 면역 기억이 장기간 유지될 수 있는지 여부와 항체 또는 T 세포가 지속적인 보호를 제공할 수 있는지 여부는 추가 조사가 필요하며 이 영역에 대한 이해는 백신 개발에도 도움이 될 것입니다.
여기서 우리는 COVID-19 종적 후속 코호트에서 최대 1년까지 바이러스 특정 체액 및 세포 면역 반응의 동적 변화를 분석합니다. 이 대표적인 환자 코호트에서 SARS-CoV-2 특정 IgM 및 IgA 수치는 1년 이내에 기본 수준으로 크게 감소했습니다. Spike-specific IgG와 혈청 보호 능력은 처음 6개월 이내에 크게 떨어졌지만 최대 1년 동안 유지되었습니다. SARS-CoV-2 특정 T 세포 면역 반응은 퇴원 후 최대 1년까지 안정적으로 유지되었습니다. 이러한 결과는 SARS-CoV-2에 대한 보호 면역 반응이 최소 1년 동안 지속될 수 있음을 의미합니다.
결과
COVID-19 코호트 특성.
2020년 1월 20일부터 2월 29일까지 중국 광저우 광저우 제8인민병원에 입원한 같은 기간의 환자 299명 중 회복된 204명(68.2%)의 대표 코호트가 이 후속 연구에 참여했습니다. 이 중 29명은 중증, 162명은 중등도, 12명은 경증, 1명은 무증상으로 진단받았다(Table 1). 그들의 연령과 성별은 전체 환자 집단을 대표했습니다(그림 1 참조). 유일한 무증상 환자를 제외하고 모든 개인은 여러 시점에서 혈액 샘플을 기증했습니다. 다행스럽게도 50명(204명 중 24.5%)이 전체 후속 조치를 완료하고 네 번의 후속 시점에서 혈액 샘플을 제공했습니다. 따라서 면역 기억의 동역학 평가가 가능했습니다. 요컨대, 후속 코호트는 2020년 초 광저우의 전체 COVID-19 환자 모집단을 나타냅니다.
SARSCoV-2에 대한 체액성 항체의 세로 변화.
스파이크 SARS-CoV-2의 수용체 결합 도메인(RBD)은 수용체인 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)에 대한 바이러스 결합에 필수적인 역할을 합니다. 중화 능력7. 우리는 2단계 간접 면역분석 전기화학발광 면역분석 키트를 사용하여 시간 경과에 따라 순환하는 RBD 특정 IgM, IgA 및 IgG 항체의 동역학을 분석했습니다8.
First, all patients were positively seroconverted (at least one IgM >1 COI, IgA >1 COI, or IgG >1 COI) 최소 1회 이상의 시점으로, 선택된 모든 환자에 대해 실제 SARS-CoV-2 감염이 발생했음을 확인했습니다. 중증 환자는 병원 단계의 중등도 환자보다 RBD-IgA, RBD-IgG 및 스파이크-IgG가 상당히 높았지만 RBD-IgM은 그렇지 않았습니다(그림 1a-d 및 보충 그림 2). 우리의 결과는 바이러스에 대한 면역 체계의 장기간 노출이 바이러스 특정 항체 생성을 향상시킨다는 것을 뒷받침했습니다.
다음으로, 우리는 RBD-특이적 IgM 수준이 4.669(이하 평균 COI)에서 0.785(음성)(약 6배, p < 0)로 급격하게 감소함을 발견했습니다.0 001, Welch 보정을 사용한 짝이 없는 t-테스트) 퇴원 후 3개월 이내(그림 1a). RBD 특정 IgA도 3개월 이내에 9.283에서 3.234(2.86-배, p < 0.0001, unpaired t-test with Welch's correction)로 크게 감소했지만 최대 6개월(3.491, p { {24}}.073, Welch 보정을 사용한 짝이 없는 t-검정). 마침내 RBD-IgA는 12-월 시점(0.57)에서 음성이 되었습니다(p < 0.0001, Welch 보정을 사용한 unpaired t-test)(그림 1b). IgA는 점막에서 중화 기능을 수행하기 때문에 점막 조직보다 혈청 농도가 정점에서도 낮을 것으로 예상되었습니다. 점막 조직이 안정적인 IgA를 유지할 수 있는지 여부는 추가 조사가 필요합니다.
RBD-IgG는 바이러스 감염에 대한 면역 보호의 중요한 지표로 간주되었습니다. 우리의 분석에 따르면 RBDIgG는 처음 3개월 이내에 825에서 287 AU/ml로 2.87-배 감소했습니다(p < 0.0001, Welch의 보정을 사용한 짝이 없는 t-테스트). 이전 보고서5,6 .
특히, RBD-IgG 수준은 1년까지 안정적으로 유지되었습니다(평균 170 AU/ml, 그림 1c). 독립적으로 측정된 전장 스파이크-IgG의 수준은 RBD-IgG와 유사한 패턴을 나타냈으며(그림 1d), 항체가 급격한 감소 후 6개월에서 1년까지 안정적으로 유지된다는 위의 관찰을 더욱 확증합니다.
RBD-IgG 및 전장 스파이크-IgG 수준은 강한 양의 상관관계를 보였다(r=7411, p < 0.0001,n=474, Pearson 상관관계, 그림 1e). RBD-IgG와 전장 스파이크-IgG 사이의 강력한 양의 상관관계가 여러 시점에서 관찰되었습니다(그림 1e 및 보충 그림 3).
Thus, RBD-IgG was used in the following analysis. To investigate what kind of patients tends to maintain long-term RBD-IgG-producing capacity, we test the influence of initial antibody titers on antibody persistence. We divided the follow-up individuals with at least the first three follow-up visits into high RBD-IgG (maximal titer >1000 AU/ml) 및 낮음(100 < 최대 역가<1000 AU/ml) groups. We observed that the high group had significantly higher RBD-IgG levels at the in-hospital stage (p = 0.0004, an unpaired t-test with Welch's correction), 1-month (p = 0.0026, an unpaired t-test with Welch's correction), and 3-month (p = 0.0363, an unpaired t-test with Welch's correction) visits. But the difference diminished at the 6-month visit (p = 0.2212, an unpaired t-test with Welch's correction) and the 12-month visit (p = 0.7074) (Fig. 1f). Next, we demonstrated that disease severity does not necessarily contribute to higher RBD-IgG maintenance with individuals with at least three continuous follow-up serum samples (Fig. 1g). Therefore, our results showed that neither the antibody levels nor the disease severity would affect the RBD-specific IgG antibody persistence.
Fig. 1 Kinetics of SARS-CoV-2 viral-specific antibodies up to 1 year. SARS-CoV-2-infected individuals who attended the follow-up program were included in this analysis. a–c RBD-IgM, IgA, and IgG changes since symptom onset. x-axis, follow-up time (day). y-axis, antibody titer (COI cut-off index; or arbitrary unit, AU/ml). The shaded regions represent the in-patient stage. The average values in the 1-month, 3-month, 6-month, and 12-month stages were labeled. P values (two-tailed) were shown. Mild (black dots), moderate (blue dots), and severe (red dots) symptoms. d Full-length spike-IgG changes since symptom on-set. x-axis, follow-up time (day). y-axis, antibody titer (AU/ml). e Correlation of RBD-IgG and Spike-IgG. In-hospital stage (black), 1-month follow-up (red), 3-month follow-up (blue), 6-month follow-up (purple), and 12-month follow-up (green). Pearson r number and p-value (two-tailed) were shown. f Longitudinal analysis of RBD-specific IgG between patients with high titer (RBD-IgG >1000 AU/ml, 주황색 원) 및 역가가 낮은 환자(RBD-IgG<1000 AU/ml, empty circle). g Longitudinal analysis of RBD-specific IgG between severe patients (red circle) and moderate patients (pink circle). Lines in the x-axis and y-axis in a–e indicate the cut-off values. a–d, Mean values were labeled for each column. f, g, Data were presented as median with interquartile range. An unpaired t-test with Welch's correction analysis was applied, and p-values (two-tailed) were labeled. Source data are provided as a Source Data file.
SARS-CoV-2에 대한 혈청 보호 역학.
우리는 바이러스 감염에 대한 혈청 보호를 평가하기 위한 황금 표준인 살아있는 SARSCoV-2 감염 시스템을 사용하여 혈청 미세중화 분석을 수행하여 혈청이 SARS-CoV-2 감염에 대해 여전히 보호하는지 여부를 조사했습니다. 우리는 혈청 중화 역가가 1개월에서 3개월(p=0.0024, Welch의 보정을 사용한 unpaired t-test) 및 6개월(p=0.0168, unpaired t-test)로 감소했음을 발견했습니다. RBD-IgG 및 Spike-IgG와 유사한 방식으로 Welch 보정으로 테스트합니다(그림 2a). 그 후, 그들은 12-개월까지 안정적으로 유지되었습니다(p=0.591, Welch의 수정과 짝을 이루지 않은 t-테스트). 이는 SARSCoV-2 특정 체액 보호가 장기적으로 지속될 수 있음을 의미합니다.
중증 환자는 중등도 환자보다 높은 수준의 항체를 생성했기 때문에 높은 수준이 더 강력한 보호를 제공할 수 있는지 여부는 아직 알려지지 않았습니다. 우리는 심각한 증상이 초기 회복기 단계(p=0.020, Welch의 교정과 짝을 이루지 않은 t-테스트)에서 일시적으로 더 높은 중화 능력을 초래한다는 것을 발견했으며, 이는 3-개월에서 { {4}}년 방문(그림 4 참조).
그런 다음 RBD-IgG와 혈청 미세중화의 상관관계를 분석하였다. RBD-IgG와 중화(r=0.4070, p < 0.0001, n {{6} }, 피어슨 상관관계)(그림 2b). 당연히 Spike-IgG의 수준은 혈청 중화 능력과 양의 상관 관계가 있습니다 (그림 4 참조). 주목할 점은 RBD-IgG와 혈청 중화 사이의 상관관계는 입원 기간 동안 통계적 유의성에 도달하지 못한 반면(r= 0.2101, p= 0.0905, Pearson correlation, Supp. Fig. 5a). 1-월(r= 0.3952, p < 0.0001, Pearson 상관관계), 3-월(r= 0.2769, p= 0)에 긍정적으로 유지됨. 0135, 피어슨 상관관계), 6-월(r= 3846, p= 0.0005, 피어슨 상관관계) 및 12-월(r= 0.5216, p < 0.0001, Pearson 상관 관계) 방문 (그림 5b-e).
SARS-CoV-2 특정 T 세포 면역 반응의 동역학.
바이러스 특정 기억 T 세포는 결국 바이러스 감염 세포를 제거함으로써 질병의 중증도를 줄일 수 있으며9, 바이러스 감염이 발생했을 때 퇴치하는 또 다른 중요한 지점을 형성합니다. 보호 T 세포 면역 반응이 지속될 수 있는지 여부를 조사하기 위해 우리는 가장 풍부한 바이러스 단백질로 인해 Nucleoprotein(N) 펩타이드 풀을 생성했으며10 바이러스 감염 및 광범위한 적용에서의 중요성 때문에 Spike 펩타이드 풀을 생성했습니다6. 편리한 취급을 위해 스파이크 펩티드를 사용하여 S1 및 S2 펩티드 풀을 생성했습니다. 우리는 6-개월 및 12-개월 방문에서 새로 분리된 PBMC를 사용하여 바이러스 특정 T 세포의 감마 인터페론(IFN-) 효소 연결 면역흡착점(ELISPOT) 분석을 위해 3개의 펩타이드 풀을 사용했습니다. 한 대표 개인의 ELISPOT 검출 결과가 표시되었습니다(그림 3a).
병원의 회복기 환자와 비교할 때 총 바이러스 특이 IFN-분비 세포는 6-개월 방문에서 감소했으며 12-개월 방문까지 안정적으로 유지되었습니다(그림 3b). N, S1 및 S2 단백질에 대해서도 유사한 변화가 관찰되었습니다(그림 3c). 중증 환자는 스파이크 단백질에 대해 지속적으로 강한 T 세포 면역을 생성하는 것으로 보입니다(그림 7 참조). SARSCoV-2 T 세포 반응의 구성 분석은 N, S1 및 S2의 백분율이 약간의 감소만으로 잘 유지되는 것으로 나타났습니다(그림 3d). 200311의 SARS 감염으로.
논의
한 측면에서 우리 연구는 SARS-CoV-2 특정 체액성 면역 반응이 최대 1년 동안 유지될 수 있음을 보여주었습니다. 바이러스 특이 RBD-IgG, Spike-IgG 및 혈청 중화 능력이 이전 보고와 유사하게 6개월 이내에 빠르게 감소하는 것을 관찰했습니다5,6,12,13. 다행히 세 가지 매개변수는 그 후 1년 동안 안정적으로 유지됩니다. 바이러스 특이적인 IgG는 당분간 현재 수준을 유지할 수 있을 것으로 보인다.
그림 2 SARS-CoV-2 감염에 대한 혈청 보호의 종단 분석. 여러 시점에서 수집한 혈청을 살아있는 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 대해 테스트했습니다. 살아있는 SARS-CoV-2 감염 세포 배양 시스템을 사용하여 미세 중화 분석을 수행했습니다. y축, 혈청 희석 주름. 데이터는 평균값 ± SEM으로 표시되었습니다. 유색 점은 질병의 중증도를 나타냅니다. 경증(빈 점), 중등도(파란색 점) 및 중증(빨간색 점) 증상. Welch의 보정 분석과 짝을 이루지 않은 t-테스트를 적용하고 p-값(양측)을 표시했습니다. b 미세중화(희석 접힘)와 RBD-IgG(임의 단위, AU/ml)의 상관관계. 총 475쌍을 분석하였고 Pearson r 및 p 값(양측)을 나타내었다. a와 b의 x축과 y축의 선은 컷오프 값을 나타냅니다. 소스 데이터는 소스 데이터 파일로 제공됩니다.
그림 3 회복된 COVID-19 환자의 SARS-CoV-2 특정 T 세포 반응. IFN-분비 세포를 표시하는 대표적인 ELISpot 웰 이미지. N, S1 및 S2, 뉴클레오캡시드(N), 스파이크 1 서브유닛(S1) 및 2(S2)의 합성 중첩 펩티드 풀. Con A, Concanavalin A 양성 대조군. b 시간이 지남에 따라 SARS-CoV-2 특정 면역 반응의 감소를 나타내는 IFN 분비 세포의 스팟 번호. 숫자는 N, S1 및 S2-자극 웰의 합계입니다. 데이터는 사분위수 범위의 중앙값으로 표시되었습니다. c Raincloud 플롯은 서로 다른 추적 시점에서 세 가지 펩타이드 풀 사이에서 서로 다른 T 세포 반응 수준을 보여줍니다. d 1-년 후속 조치 동안 SARS-CoV-2 응답의 구성 비율을 보여주는 와플 점도표. Mann-Whitney U-test에 의한 통계. P 값(양쪽 꼬리)이 표시되었습니다. b, c 데이터는 box-and-whisker 플롯(사분위간, 상한 및 하한이 있는 중앙값)으로 표시되었습니다. 소스 데이터는 소스 데이터 파일로 제공됩니다.
다른 측면에서 우리의 연구는 SARS-CoV-2 특정 T 세포 반응이 장기적으로 상대적으로 안정적일 수 있음을 보여주었습니다(그림 3). 이 관찰은 현재 상황에서 매우 중요합니다. B.1.1.7(또한 501Y.V1, 영국 변형), B.1.351(또한 501Y.V2, 남아프리카 변형), B.1.617.1 및 B.1.617.2(인도 변종), B.1.525(또한 20A, 나이지리아 변종) 및 B.1.1.28.1(또한 501Y.V3, 브라질 변종)이 더 높은 전염성 또는 병원성 또는 둘 다로 나타났습니다. 주로 RBD 도메인에서 발생하는 새로운 돌연변이는 자연 감염 또는 SARS-CoV-2 백신 접종을 통해 얻은 중화 보호를 잠재적으로 피할 수 있습니다15,17,18.
중화 항체와 달리, 바이러스 특이적 T 세포는 바이러스가 세포로 들어가는 것을 차단할 수 없지만 바이러스 펩티드를 제시하는 바이러스 감염 세포를 직접 파괴함으로써 세포 내 바이러스를 죽일 수 있습니다2,11. 수많은 바이러스 에피토프19가 주요 조직 적합성 복합체 제시를 위한 Spike 단백질 이외의 바이러스 단백질에서 생산될 수 있기 때문에 새로운 돌연변이는 T 세포 면역 감시를 쉽게 깨뜨릴 수 없습니다. 이러한 관점에서 내구성 있는 바이러스 특정 T 세포 면역 반응을 유도할 수 있는 백신은 SARS-CoV-2에 대한 효과적인 집단 면역을 구축할 수 있을 것입니다.
행동 양식
환자 정보.
광저우 정부가 지정한 공식 병원인 광저우 제8인민병원은 2020년 1월부터 2020년 3월까지 SARS-CoV-2 풍토병 확산 1차 유행 기간 동안 COVID-19 환자를 접수하고 치료했습니다. 광저우 제8인민병원이 이 후향적 연구에 등록되었습니다. 204명의 환자가 1회 이상 제공하여 후속 연구에 참여하였다. 연령, 성별, 임상 진단을 포함한 일반적인 환자 정보는 병원 정보 시스템에서 수집되었습니다. 모든 환자는 국가위생건강위원회가 발표한 신종 코로나바이러스 폐렴 진단 및 치료계획(시험판 7)의 기준에 따라 진단을 받았다. 심각한 증상 진단은 다음 기준에 따랐습니다.
1. 호흡 곤란, 호흡수(RR) 휴식 상태에서 분당 30회 이상.
2. 휴식 상태에서 산소 포화도가 93% 이하입니다.
3. 동맥혈 산소 분압(PaO2)/산소 농도(FiO2) 300 mmHg 이하).
4. 악화된 흉부 방사선 촬영(X-Ray 및 고해상도 CT 촬영)을 보조 수단으로 사용합니다.
중등도 증상은 환자가 눈에 보이는 폐렴, 발열 및/또는 기타 호흡기 증상이 있을 때 진단되었습니다. 가벼운 증상은 약간 불편하지만 폐렴 증상이 없을 때 진단되었습니다. 무증상 환자는 임상증상이 없으나 확진자와 바이러스 노출 또는 밀접 접촉 후 추적관찰 단계에서 SARS-CoV-2 바이러스 RNA 양성으로 확인된 경우로 진단하였다.
정의.
이 후속 프로그램에 참여하는 모든 개인은 입원 환자와 후속 단계의 두 단계로 나뉩니다. 후자는 1-개월(퇴원 후 60일 이내), 3-개월(70~135일), 6-개월(150~220일) 및 {{11 }}개월(280~360일).
바이러스 특이 IgA, IgG 및 IgM 항체 측정.
혈장 또는 혈청 샘플을 56도에서 30분 동안 비활성화하고 -80도에서 보관한 후 테스트했습니다. 혈장 샘플의 SARS-CoV-2 RBD 스파이크 단백질에 대한 IgA, IgG 및 IgM 항체를 제조업체의 지침에 따라 2단계 간접 면역분석 전기화학발광 면역분석 키트(Kangrun Biotech Co., Ltd.)로 테스트했습니다. 간단히 말해서, 혈청 샘플을 먼저 변형된 미립자와 함께 배양했습니다. 마이크로입자는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD와 인간 항체의 Fc 도메인에 대한 아크리딘 에스테르 표지 항체로 코팅되었습니다. 결합되지 않은 물질을 여러 차례 씻어낸 후 자동 화학발광 면역 분석기(KAESER1000, Chongqing Cosmax Biotech Co., Ltd.)에서 신호 검출을 수행했습니다.
유사하게, 혈장 샘플에서 SARS-CoV-2 전체 길이 스파이크 단백질에 대한 IgG 항체는 제조업체의 지침에 따라 2단계 간접 면역분석 전기화학발광 면역분석 키트(Mairui Biotech Co., Ltd.)를 사용하여 테스트되었습니다. 모든 테스트는 엄격한 생물학적 안전 조건에서 수행되었습니다. 항체 역가는 혈청 샘플당 1회 테스트되었습니다. 항체 수준은 측정된 화학발광 값을 컷오프(컷오프 지수, COI)로 나눈 값으로 표시됩니다. COI<1 was regarded as negative, and COI >1은 양성으로 간주되었다.
미세중화 검정.
열 불활성화 혈청을 4배(1:4에서 1:1024로) 연속 희석한 다음 SARS-CoV-2의 100 TCID50을 포함하는 바이러스 용액의 동량(125ul)과 혼합했습니다. 다음으로, 혈청-바이러스 혼합물을 먼저 37도에서 2시간 동안 배양한 다음 반컨플루언트 VERO E6 단층에 이중으로 적용했습니다. 4-일 배양 후, 바이러스에 감염된 웰을 평가했습니다. 가시적인 세포병원성 효과가 있는 웰은 양성 바이러스 감염으로 정의되었습니다.
인간 IFN-ELISPOT 검정
IFN-ELISPO 분석은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다. {5}}) 4℃에서 하룻밤. 2mM L-글루타메이트, 10mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산[HEPES], 10% 태아 소 혈청[FBS] 및 페니실린/스트렙토마이신(1×)) 37℃에서 2시간. 새로 분리된 PBMC를 SARSCOV-2 S1 또는 S2 또는 N 펩타이드 풀(GenScript, China)의 존재 하에 37℃에서 24시간 동안 플레이팅하고 자극했습니다. SARS-COV{{29 }} 펩타이드는 길이가 20개의 아미노산이며 순차적인 펩타이드 간에 10개의 아미노산이 겹칩니다. 플레이트를 PBS-Tween 20(PBST)으로 세척한 다음 비오티닐화된 항인간 IFN- 검출 항체(U-Cytech, 네덜란드, No. CT640-10) 및 알칼리 포스파타제(AKP)-접합된 스트렙타비딘(BD , 미국, 번호 554065). 반점은 NBT/BCIP(Pierce, USA)에서 10분 동안 배양하여 개발되었습니다. 반점은 ELISPOT 판독기(Bioreader 4000, BIOSYS, Germany)를 사용하여 계산되었습니다. 반점 형성 세포(SFC)의 수는 백만 개의 PBMC당 항원 특이적 IFN- -분비 세포의 수로 보고됩니다.
통계 분석.
Welch's correction, Chi-square test, Pearson correlation test를 사용한 unpaired t-test는 GraphPad PRISM 소프트웨어(Version 5.01)에서 데이터를 분석하는 데 사용되었습니다. R 스튜디오(버전 4.0.2)와의 다중 비교를 위해 Mann-Whitney U-테스트 및 Kruskal-Wallis 순위 합계 테스트를 사용하여 그룹 간의 차이를 비교했습니다.
윤리적 승인.
이 연구는 광저우 제8인민병원 의료윤리위원회의 승인을 받았습니다(No. 202001134 및 202020153). 자원 봉사자로부터 서면 동의를 얻었습니다.
보고 요약.
연구 설계에 대한 추가 정보는 이 문서에 링크된 Nature Research Reporting Summary에서 확인할 수 있습니다.
데이터 가용성
저자는 이 연구 결과를 뒷받침하는 모든 데이터가 논문과 보충 정보 파일에서 사용 가능함을 선언합니다. 소스 데이터는 소스 데이터 파일로 포함됩니다. 원본 데이터는 이 백서에서 제공됩니다.
참조
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감사의 말
이 연구에 간접적으로 기여한 COVID-19 후속 그룹의 모든 구성원에게 감사드립니다. 이 환자들을 돌보고 격리 병동에서 샘플을 채취한 모든 의사와 간호사들에게 감사드립니다. 또한 샘플을 취급하고 광저우 제8인민병원에서 측정을 수행한 모든 실험실 기술자에게도 감사드립니다. 이 작업은 중국 국립 자연 과학 재단(Nos. 81670536, 81770593 및 82061138006), 주요 전염병 통제에 대한 국가 그랜드 프로그램(2017ZX10202203-004-002 및 2018ZX10301404-003-002), 광동성 부서의 지원을 받았습니다. of Science and Technology Fund(No. 2020B1111330002), Guangzhou Health Science and Technology Program(20211A010029), SGC(Sino-German Center for Research Promotion)의 코로나19 상황에서 중국과 독일 간의 양자 협력 제안을 위한 신속한 대응 자금 조달 요청{{14 }} 관련 연구(No. C-0032), 광저우 연구실 긴급 키 프로그램(EKPG21-29).
저자 기여
XD, FH, CL, XT 및 FL은 연구 설계, 연구 감독 및 데이터 분석을 담당했습니다. FH와 FL이 논문을 썼습니다. CF, YW, HH, FC, GT, YL, JL, JC 및 MJ는 환자 모집 및 샘플 및 임상 데이터 수집을 담당했습니다. JS, PL, LF 및 LC는 시퀀싱 및 생물 정보학 분석을 수행했습니다. QF, LG, SC는 바이러스 RNA 검출 및 항체 검사를 실시했다. CK는 미세중화 분석을 수행했습니다.
경쟁 관심
저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
추가 정보
자료에 대한 서신 및 요청은 XD, FH, XT 또는 FL로 보내야 합니다.
피어 리뷰 정보 Nature Communications는 이 작업의 피어 리뷰에 기여한 Bin Cao와 다른 익명의 리뷰어(들)에게 감사를 표합니다. 피어 리뷰어 보고서를 사용할 수 있습니다.
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