Colaconema Formosanum(Rhodophyta)의 R-Phycoerythrin, 코스메슈티컬용 항알레르기 및 콜라겐 촉진 물질

추상적인:시탕슈홍조류에서 발견되는 색소 복합체인 (cistanche)를 추출 및 정제하였습니다.새로 확인된 홍조류에서,콜라코네마 포르모사눔, 및 그것의 생물 활성을 검사했습니다. 그것밝혀졌다시탕슈 트리트먼트 resulted in high cell viability (>70% ) 포유류 세포주에NIH-3T3, RBL-2H3, RAW264.7 및 Hs68은 NIH-3T3 세포의 세포 형태에 영향을 미치지 않았습니다.IL-6 및 TNF- 생성에 대한 억제 효과는 미미하였다. lipopolysaccharide 자극RAW264.7 셀. 그러나, 칼슘 이온 운반체 A23187- 유도 -헥소사미니다제 방출RBL-2H3 세포에서 용량 의존적으로 효과적으로 억제되었다. 추가로 밝혀졌다.생체 공학 표피 조직에 자극적이지 않아야 합니다. 특히, 프로콜라겐 생산은Hs68 세포. 전반적으로, 데이터는담배에서 정제C. 포모사눔항알레르기를 나타내고여러 포유동물 세포주에서 결과적으로 독성이 관찰되지 않는 노화 방지 생체 활성뿐만 아니라 표피 조직, 이 거대 분자가 잠재력을 위한 새로운 물질임을 시사합니다.화장품 사용.

키워드: 화장품; Colaconema formosanum;시탕슈; 항알레르기;노화 방지

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1. 소개

조류는 육지와 바다에서 발견되는 광합성 유기체입니다. 바다의 주요 생산자의 일부인 조류는 다른 유기체에 산소와 영양분을 공급하여 해양 생태계를 조절합니다. 거대조류(해조류라고도 함)는 해안 지역에서 자라며 육상 식물에서 일반적으로 발견되는 전형적인 기관을 가지고 있지 않습니다.1]. 대형조류는 색소에 의해 구별할 수 있으며 Chlorophyta(녹조류), Rhodophyta(홍조류) 및 Phaeophyceae 강(갈조류)의 세 그룹으로 분류됩니다.1]. 거대조류의 성장 속도는 상당히 빠르며, 단백질, 폴리페놀, 색소와 같은 생체 활성 화합물의 생산을 제어하기 위해 성장 조건을 조작하는 것이 가능합니다.2]. 특히, 해초 유래 화합물에 대한 지식 습득이 증가함에 따라 이러한 화합물을 의료 및 식품 첨가물 응용 분야에서 사용하기 위한 연구 개발이 증가했습니다.3–6]. 또한 화장품에서 합성 화합물보다 천연 성분이 더 안전한 경향이 있기 때문에 천연 성분에 대한 선호도가 높아지고 있습니다. 조류에는 불포화지방산, 폴리페놀, 다당류, 아미노산, 색소 등 생리활성 물질이 풍부한 것으로 보고되고 있다.7,8]. 그들 중 일부는 phycobiliproteins로 알려진 색소 복합체를 함유하고 있으며, 이는 다음으로 분류될 수 있습니다.피코에리트로시아닌(PEC), 피코시아닌(PC), 피코에리트린(PE) 및 알로피코시아닌(APC) [9]. 홍조류의 주요 색소인 PE는 C-피코에리트린(C-PE), B-피코에리트린(B-PE), 시스탄케(Cistanche)로 더 세분될 수 있으며 흡수 스펙트럼에 따라 그룹에 따라 분류됩니다. 이를 생산하는 광합성 유기체: C는 시아노박테리아, B는 Bangiophyceae(원시 사상성 Rhodophyta), R은 더 복잡한 Rhodophyta [10]. 이러한 색소 중에서 cistanche는 홍조류에서 가장 풍부한 phycobiliprotein입니다. cistanche는 수용성 올리고머 단백질로 동료 세포 계측법, ELISA 분석 및 형광 현미경 검사에서 형광 태그로 일반적으로 사용됩니다.11–14] 뿐만 아니라 암 치료에서 감광제 [15]. 또한 PE는 항바이러스, 면역 강화, 항산화, 항염증 및 항종양 효과를 포함한 생물학적 특성을 나타내는 것으로 입증되었습니다.15] 더 많은 관련 정보를 얻기 위해) 식품 및 생물 의학 산업, 분자 생물학 연구, 염료 및화장품 응용 [11,15,16].

노화특히 장시간 햇빛(또는 자외선)과 오염된 공기에 노출된 사람들에게 피부와 관련된 주요 문제 중 하나입니다. 그래서 대부분의 스킨케어 관련 제품은 피부를 보호하고 노화를 늦추는 데 중점을 둡니다. 피부는 인체의 1차 방어선으로 일상생활에서 피할 수 없는 공해, 햇빛, 산화스트레스 등으로 인한 손상이 누적되는 것을 방지하는데 도움을 줍니다.17]. 최근 몇 년 동안 소비자들은 화장품의 화학 성분에 대해 회의적이 되었습니다. 따라서 천연 자원을 사용하여 생산된 환경적으로 지속 가능한 제품에 대한 수요가 증가하고 있습니다.1]. 다음과 같은 조류 추출물Arthrospira그리고클로렐라 불가리스, 피부에 타이트닝 효과를 발휘하고 줄무늬 형성을 방지하며 콜라겐 합성을 촉진하여 유익한 것으로 보고되었습니다.18]. 분명히 이러한 노화 방지 효과를 담당하는 생체 활성 화합물에는 황산화 다당류, 페놀 화합물, 펩타이드, 마이코스포린 유사 아미노산 및 색소가 포함됩니다.19,20]. 또한, 조류추출물로부터 정제된 생리활성물질에 대하여 피부에 유익한 특정 생리활성을 조사하였으며, 비교적 안전한 것으로 과학적으로 입증되어 전체 추출물이 아닌 정제된 생리활성물질을 이용한 화장품 제형화를 가능하게 하였다.21]. 따라서 조류에서 추출한 추출물이나 정제된 대사산물을 함유한 코스메슈티컬에 대한 수요가 높다.1]. 선행 연구에서 안정적인 바이오매스 생산을 위한 기술적으로나 경제적으로 실현 가능한 재배 전략은콜라코네마 포르모사눔2021년 Lee와 Yeh에 의해 성공적으로 설립되었습니다.콜라코네마 포르모사눔실내 시스템을 사용하여 대만 남부에서 [22,23]. 기생조류로서,C. 포모사눔macroalga에서 처음으로 분리되었습니다.Sarcodia suiae대만 남부에서 [23]. 높은 단백질(건조 중량의 30%)과 높은 시트탄슈 함량(5 mg/g−1 dw) 이 종에 대해 발견 [22], C. 포모사눔cistanche 추출에 엄청난 산업적 이점을 보여 주며 citanche의 시장 가격을 더 저렴하게 만들 것으로 예상됩니다. 또한, 우리 그룹은C. 포모사눔[24]. 우리가 아는 한, cistanche의 효과는C. 포모사눔화장품 산업에서 새로운 생체 ​​재료로서의 잠재력뿐만 아니라 포유류 세포에 대한 가능성은 아직 탐구되지 않았습니다. 따라서 본 연구에서는 이러한 가설을 검증하기 위해 세포독성, 탈과립분석, 항염증능, 항알레르기 시험, 프로콜라겐 합성 시험 등 다양한 in vitro 분석을 시행하였다.

2. 재료 및 방법

2.1. Colaconema Formosanum에서 Cistanche(cistanche) 추출

조류는 20일 배양기(Tominaga, Taipei City, Taiwan)에서 배양하였다.± 1 ◦C, 60 ± 10 µ몰 광자 m−2 s −1 (발광 다이오드, LED 백색광) 및 12:12 h 조명: 4L의 멸균된 PES 해수 배지(30psu)가 있는 5L 비이커에서 며칠 동안 어두운 광주기를 수행하여 작업 샘플을 얻습니다. 다음으로 씨스탄슈를 추출하는 방법은C. 포모사눔이 연구에서 Lee et al.에 의해 보고된 방법에서 수정되었습니다. [24]. 첫째, 신선한 조류에서 phycobiliproteins을 추출했습니다.C. 포모사눔(습윤 중량 100g) 1L의 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4), 4◦C. phycobiliprotein 분해 방지실험 중 5mM NaN3 및 4mM EDTA를 PBS에 첨가하였다. 신선한 조류FastPrep{0}} 균질화기(TeenPrep, 6주기, 4.0m·s−15초 동안;MP Biomedicals, 미국 오하이오주 솔론). 추출물을 거칠게 여과하여 이물질을 제거하고,여액을 배럴 원심분리기(Beckman Coulter, Brea, California, USA)를 사용하여 20000 rpm에서 원심분리하였다. cistanche 추출물이라고 불리는 붉은색 상청액을 수집하고4에 저장◦C 어둠 속에서. cistanche 추출물은 이후에 분류되었습니다.(NH4)2그래서4 20~60%(w/v) 4에서 채도◦C. 고체 황산 암모늄이 천천히부드럽게 교반하여 첨가하고, 용액을 2시간 동안 방치한 후, 원심분리하였다.10에서, 000 rpm에서 4에서 20분◦C 및 침전물 형성. 침전물이 용해되었다PBS(pH 7.4)에서 동일한 버퍼에 대해 밤새 투석했습니다. 투석된 붉은색솔루션이 0을(를) 통과했습니다.22-µm 멤브레인 필터(Merck Millipore, Burlington, MA,미국).

2.2. Fast Protein Liquid를 사용한 이온 교환 크로마토그래피에 의한 식감 정제크로마토그래피(FPLC)

투석된 cistanche 샘플은 이온 교환 크로마토그래피에 적용되었습니다.10 mM NaCl을 포함하는 50 mM PBS(pH 7.4)로 사전 평형화된 로드된 HiTrap DEAE FF 컬럼(5 mL). 샘플을 통과시킨 후, 컬럼을 평형 완충액을 사용하여 광범위하게 세척하였다. 이어서 이온 교환 크로마토그래피를 0.0 내지 500mM NaCl 범위의 선형 구배 용리를 사용하여 5mL/분의 용출 속도로 수행하였다. 용출된 적색 분획을 수집하였다. 용출된분획은 NGC 중압을 사용하여 UV-Vis 분광광도법으로 분석했습니다.280, 498, 566의 파장에서 크로마토그래피 시스템(BIO-RAD, Hercules, CA, USA),및 620nm. 얻은 cistanche 분획은 흡수를 사용하여 추가로 분석되었습니다.300에서 700 nm까지의 스펙트럼이며 0을 통과했습니다.22-µm 필터(머크 밀리포어,벌링턴, 메사추세츠, 미국).

2.3. 세포 배양

뮤린 대식세포 세포주로서 RAW264.7을 4가 함유된 DMEM으로 배양하였다.mM L-글루타민, 1.5g/L 중탄산나트륨 및 10% FBS.모든 세포주는 일관되게 유지되었고 다음과 같이 설정된 습한 챔버 내에 보관되었습니다.5% CO로 37도2, 표준 절차를 사용하여 일주일에 두 번 맞았습니다.

2.4. 형태학적 등급 및 세포 생존력

시험NIH-3T3 세포를 96-웰 플레이트(1× 104 웰당 세포, Corning, New York, NY, USA)를 배양 배지로 처리하고 밤새 침전되도록 두었다. 그런 다음 세포를 {{0}}(음성 대조군), 0.25, 0.5, 1, 2, 5 및 10을 포함하는 배양 배지로 처리했습니다.µg/mL의 계피 추출물. 10% DMSO가 보충된 배지를 포함하는 웰(Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)도 양성 대조군으로 실험에 포함되었습니다. 24-h 인큐베이션 후, [25], 등급 0, 1, 2, 3 및 4는 없음, 약간,경증, 중등도 및 중증 반응성. 배양 배지를 1 mg/mL MTT 시약(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 48-h 후처리로 교체하고 3시간 동안 배양하였다. Formazan을 녹이기 위해 MTT 시약을 제거한 후 Isopropanol을 well에 넣고 plate를 분광광도계(Jasco Spectrophotometer V-630)를 이용하여 570 nm의 파장에서 분석하였다.26]. 최고 시스탄슈 추출물 용량에 대한 세포 생존율 수준이 대조군의 70% 미만인 경우 세포독성이 있는 것으로 간주되었습니다.25]. 세포 생존율의 백분율은 다음 방정식을 사용하여 계산되었습니다.

세포 생존율(광학 밀도, OD) =(노출된 세포의 OD/대조군 세포의 OD)× 100

2.5. 항염증 테스트

결정하기 위해항염cistanche, interleukin-6(IL-6) 및 종양 괴사 인자-알파(TNF)의 능력 )에 기술된 바와 같은 프로토콜에 따라 본 연구에서 검출되었다.27,28]. RAW264.7 세포를 24-웰 플레이트(5× 105 cells/well) (Corning, New York, NY, USA)에 넣고 밤새도록 37도에 두었습니다. 다음날, 세포를 리포폴리사카라이드(LPS, 1µg/mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 증가하는 농도의 시스탄체(0(음성 대조군), 1.25, 2.5, 5, 10 및 20µg/mL). 동시에, LPS와 p38 MAPK 억제제 SB203580(3µM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 양성 대조군으로 설정하였다. 24시간 후, 생성된 IL-6 및 TNF-의 검출을 위해 각 그룹의 상등액을 수집하였다. . 상청액 샘플을 Quantikine에 적용했습니다.® 비색 샌드위치 ELISA 키트(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). 억제율(백분율)=100× (샘플/대조군). 또한, 처리 후 세포 생존율을 평가하기 위해 세포를 MTT 분석하였다.

2.6. 탈과립 분석

쥐 호염기성 백혈병 세포주로서 RBL-2H3 세포주를 비만세포 모델로 사용한다. RBL-2H3 세포는 점막 비만 세포의 표현형을 나타내며 비만 세포 반응의 조절을 조사하기 위한 훌륭한 도구로 인식되고 있습니다.29]. 따라서 RBL-2H3 세포주는 비만 세포의 탈과립화에 대한 cistanche의 잠재적 영향을 조사하기 위해 이 테스트에 사용되었습니다. -hexosaminidase는 비만 세포의 탈과립을 모니터링하기 위한 마커로 사용되었습니다.30]. 그만큼 -hexosaminidase 검출 방법이 참조에서 수정됨 [31]. RBL-2H3 세포는 1에 시딩되었습니다.× 105 24-웰 세포 배양 플레이트(Corning, New York, NY, USA)에서 웰당 세포. 세포는 먼저 1로 처리되었습니다.µM 칼슘 이오노포어 A23187(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 이어 다양한 용량의 시스탕(0(음성 대조군), 1.25, 2.5, 5, 10 및 20µg/mL)하고 2시간 동안 배양하였다. 동시에, 100개로 배양된 세포µM 케르세틴(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 양성 대조군으로 사용하였다. 에 사용된 방법론 -헥소사미니다아제 정량화는 이전에 발표된 연구에서 얻었습니다.32,33]. 처리 후, 상층액(30µL)을 각 웰에서 수집하여 50개를 추가하기 전에 새로운 96-웰 플레이트로 옮겼습니다.µ4-니트로페닐 N-아세틸-의 L -D-글루코사미나이드(NP-GlcNAc, 구연산염 완충액(pH 4.5) 중 1.3mg/mL, 미국 미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma-Aldrich). 플레이트를 37도에서 1시간 동안 방치하고 80℃를 첨가하여 반응을 종료하였다.µ0.5M NaOH의 L. 그런 다음 분광광도계(Jasco, Halifax, NS, Canada)를 사용하여 405nm의 파장에서 p-니트로페놀레이트의 형성에 대해 플레이트를 분석했습니다. 원래 배양 플레이트에서 남겨진 세포는 처리 후 세포 생존력을 검사하기 위해 MTT 분석에 사용되었습니다.

2.7. 피부 자극 테스트

국소 적용이 피부에 자극을 유발하지 않는지 확인하기 위해 표피mal 조직은 cistanche가 조직 수준에 적용되는 시나리오를 모방하는 데 사용되었습니다. 안표피자극평가는 모든 의료기기나 화장품에 대한 핵심 테스트로, 피부에 안전하다고 판단되는 제품만을 소비자에게 제공하고자 합니다. 기존의 동물실험은 실험동물에게 통증과 불편함을 유발할 뿐만 아니라그러한 테스트가 항상 인간에게서 관찰된 효과를 대표하는 것은 아닙니다. 따라서 재구성된 생체 공학 조직을 사용하는 것은 생체 내에서 인간의 피부를 시뮬레이션하는 국소 미세 환경으로 둘러싸인 수많은 세포 유형을 소유하기 때문에 유리하다고 간주됩니다.34]. 생체 공학 표피 조직 EpiDerm™(MatTek LIFE SCIENCES, Ashland, MA, USA)을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 참고문헌에서 수정된 방법론에 따라 실험을 수행하여 피부 자극에 대한 시스탕의 효과를 평가했습니다.35–37]. EpiDerm 샘플을 포함하는 삽입물을 미리 예열된 DMEM이 포함된 6-웰 플레이트(Corning, New York, NY, USA)에 삽입했습니다. 금액 100µ{{0}}(음성 대조군) 또는 1mg/mL 정제된 물(최종 농도 0.1mg/mL)을 함유하는 L DMEM을 EpiDerm 샘플 상단의 세포 배양 삽입물에 첨가했습니다. 5% 소듐 도데실 설페이트(SDS)로 처리된 조직은 양성 대조군 역할을 했습니다. 37℃의 습한 환경에서 1-시간 배양 후◦C, 5% CO2 인큐베이터에서 삽입물을 제거하고 PBS(pH 7.4)로 두 번 세척한 다음 300µ1 mg/mL MTT 용액 L(DMEM 내). 3-시간 배양 후, 이소프로판올을 적용하여 MTT 포르마잔 결정을 용해시켰다. 상등액을 96-웰 플레이트로 옮기고 분광광도계를 이용하여 OD 570 nm에서 시료를 측정하였다. 상대 생존력은 섹션에 설명된 방정식에 따라 계산되었습니다.2.4. 화학 물질은 세포 생존율을 50% 미만으로 감소시키는 경우(범주 2) 자극제로 간주되며, 세포 생존율이 50% 이상인 화학 물질은 비자극 물질(범주 없음)로 간주됩니다.37]. 

2.8. 프로콜라겐 합성

시험Hs68 세포를 24-웰 ​​플레이트(2× 105 세포/웰) 밤새 침전되도록 방치하였다. 이어서 세포를 {{0}}, 0.625, 1.25, 2.5, 5 및 10을 함유하는 배양 배지로 처리하였다.µg/mL 계피 추출물. 양성 대조군은 100 ng/mL의 TGF(transforming growth factor)- 1 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) [38,39]. 다음으로 72-시간 후 처리, 각 샘플의 상층액을 수집하고 프로콜라겐 검출을 실시했습니다. 단클론성 항인간 프로콜라겐 타입 IC 펩티드(PIP)(일본 시가현 타카라 바이오). (MK101)은 프로콜라겐 검출을 위해 제조업체의 지침에 따라 사용되었습니다. 또한, 처리 후 세포 생존율을 평가하기 위해 MTT 분석을 수행하였다.

2.9. 통계 분석

데이터는 IBM SPSS Statistics 22.0(IBM Corp, Armonk, NY, USA)를 사용하여 분석되었습니다. 우리는 먼저 각 그룹의 데이터를 Kolmogorov–Smirnov 테스트에 적용하여 정규 분포를 확인했습니다( > 0.05) [40]. 재학생t-테스트는 세포 생존력, IL-6, TNF-를 분석하는 데 사용되었습니다. , -헥소사미니다제 억제, 표피 조직 및 프로콜라겐 생성. 모든 데이터는 수단으로 표시됩니다.± 표준 편차(SD), 각 실험은 5중으로 수행됩니다. ㅏp-value < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.