R. Vesicarius L. 시스플라틴 유발 산화 스트레스에 대한 신장 보호 효과 발휘
Mar 26, 2022
연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com
Md. Mahmudul Hasan1, 대부분. 세일라 타스민2, 아메드 M. 엘-셰하위3, 모나 엠 엘시히4, Md. 아부 레자1아리풀 하케2*
추상적인
배경:시스플라틴은 뛰어난 항암제이지만 심각한 신독성으로 그 사용량이 현저히 감소하고 있다. R. vicarious L.은 항혈관신생, 항염증, 항증식, 간보호 및 신장보호 가능성이 있는 잎이 많은 채소입니다. 따라서 이 연구는 메탄올 추출물(RVE)의 가능한 신 보호 효과를 조사하기 위해 고안되었습니다.
행동 양식:주로 in vitro에서 RVE의 항산화 활성은 2,{1}}diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 자유 라디칼 소거 적성을 기반으로 확인되었습니다. 그 후, Swiss Albino 수컷 마우스에 시스플라틴(2.5 mg/kg)을 연속 5일 동안 처리하여 신독성을 유도하였다. 다음 연속 5일 동안 복강내(ip) RVE(25, 50 및 100mg/kg)로 동물을 처리하여 신독성으로부터의 회복을 면밀히 조사했습니다. 처리 완료 후, 마우스를 희생시키고 신장을 수집하였다. 일부는 말론디알데히드(MDA) 수준을 평가하기 위해 인산나트륨 완충액에서 균질화되었고, 다른 일부는 유전자(NQO1, p53 및 Bcl{12}}) 발현을 평가하는 데 사용되었습니다. 또한 RVE의 과산화수소(H2O2) 중화 능력을 시험관 내에서 HK{15}} 세포에서 평가했습니다. 마지막으로, 가스 크로마토그래피-질량 분석법(GC-MS)을 사용하여 RVE의 생리활성 식물화학물질을 결정했습니다.
결과:RVE는 37.39 ± 1.89 ug/mL IC50 값으로 용량 의존적 방식으로 시험관 내 항산화 활성을 나타냈습니다.
RVE를 사용한 치료는 현저하게(p < {{0}}.05)="" 신장="" 조직의="" mda="" 함량을="" 감소시켰습니다.="" 또한,="" nqo,="" p53="" 및="" bcl{3}}="" 유전자의="" 발현은="" rve="" 투여로="" 용량="" 의존적으로="" 유의하게(p="">< 0.05)="" 완화되었다.="" rve는="" hk{11}}="" 세포의="" h2o2="" 수준을="" 거의="" 정상="" 수준으로="" 크게="" 반전시켰습니다(p="">< 0.05).="" gc-ms에서="" 3개의="" 알려진="" 항산화제="" "4h-pyran{15}}one,="" 2,="" 3-dihydro{18}},{19}}dihydroxy{20}}methyl-"를="" 포함한="" 10가지="" 화합물="" ,="" "헥사데칸산",="" "스쿠알렌"이="" 검출되었습니다.="" 추출물은="" 알칼로이드="" "13-도코센아미드"가="">
결론:전반적으로 RVE는 시스플라틴으로 인한 신장 손상에 대한 보호 효과가 있습니다.
키워드:Cisplatin, R. vicarious, 마우스, 신장, HK{0}} 세포, 산화 스트레스, NQO1 유전자
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소개
산화 스트레스는 활성 산소 종(ROS)의 형성과 규칙적인 항산화 방어 기작 사이의 불균형의 결과입니다[1]. 규칙적인 생화학적 반응, 불리한 환경에 대한 빈번한 노출, 생체이물 섭취의 증가로 인해 ROS가 생성됩니다[1]. ROS는 전사 인자, 단백질 티로신 포스파타제 및 단백질 키나제를 포함하는 산화환원에 민감한 신호 분자의 시스테인 잔기와 상호작용합니다. 결과적으로, 이들 잔기의 티올 그룹의 산화는 표적 단백질, 생물학적 작용, 신호 전달 능력, 면역 및 보충 세포 생/사 패러다임의 변경을 유도합니다[2]. 반응성 특성을 갖는 산소 함유 화학종은 각각 자유 라디칼 및 슈퍼옥사이드 및 H2O2와 같은 비 라디칼 분자를 포함하는 ROS로 알려져 있습니다[3]. ROS에 의해 유발되는 산화 스트레스는 암을 비롯한 수많은 질병의 원인과 관련이 있습니다. 급성 골수성 백혈병(AML)은 골수 내 혈액 세포의 암성 성장입니다. AML의 기본이 되는 세포 및 분자 사건에는 ROS 유도 산화 스트레스의 결과인 DNA 손상, 클론 전파, 증가된 세포 사멸 및 추가 유전적 불안정성이 포함됩니다[4]. 인간 생리학은 산화 스트레스로부터 세포를 보호하여 독성 효과로부터 세포를 보호하고 질병 예방에 기여하는 항산화제를 생성할 수 있는 수많은 메커니즘을 타고났습니다[5]. 그러나 세포는 산화 스트레스에 대응하고 필요한 ROS를 보존하기 위해 내인성 메커니즘을 개발합니다[6].
NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1(NQO1)은 2 또는 4전자 환원을 촉매할 수 있는 플라보효소[7]이며 이 특성을 이용하여 퀴닌을 해독합니다[8]. 산화 환원 순환을 제쳐두고 자유 라디칼 생성을 줄임으로써 세포를 산화 손상으로부터 보호할 수 있습니다[8]. 생체이물 해독 외에도 NQO1은 과산화물 중화, p53 프로테아솜 분해 조절[9], Bcl{10}} 억제[10], 세포 손상에 대한 감수성 향상[11]에도 관여합니다.
시스플라틴은 미국 식품의약국(FDA)이 승인한 최초의 백금 기반 항암제이다[12]. 시스플라틴은 산화 스트레스와 종양 억제 유전자 p53의 과발현을 유도하여 세포 사멸을 나타냅니다[12]. 신독성, 간독성, 위장독성, 이독성, 골수억제, 신경독성을 포함한 여러 부작용은 시스플라틴에 의한 산화 스트레스의 결과입니다[12]. 이러한 부작용으로 시스플라틴은 뛰어난 항암 활성을 가지고 있음에도 불구하고 사용을 현저히 감소시켰습니다. 시스플라틴은 산화 스트레스를 유발하고 쥐의 신장에서 NQO1 유전자를 억제하는 것으로 잘 알려져 있습니다[13]. 따라서 항산화제의 효과적인 천연 공급원에 대한 검색 및 검증이 인식의 영역이 되고 있습니다. 플라보노이드, 카로티노이드 및 페놀 화합물과 같은 식물 유래 식이 항산화제의 섭취는 심혈관 질환, 백내장 및 암에 대한 보호로 이어질 수 있습니다[14].
R. vicarious(Polygonaceae)는 벵골어로 "Takpalong/ Chukapalong/Amlabetom"으로 알려져 있다[15]. 아시아, 호주, 북아프리카의 사막과 반 사막 지역에서 자랍니다[16]. 방글라데시에서 거의 연구되지 않은 멸종 위기 식물입니다. 방글라데시에서는 소금, 다양한 향신료, 기름으로 요리한 후 식물 전체를 야채로 섭취합니다. 때때로 사람들은 상추 대신 신선한 잎만 혼합 샐러드에 사용합니다. 생잎은 약간 신맛이 나지만 요리 후에는 매우 신맛이 난다. 또한 생선 요리에 약간의 잎을 섞어서 요리하는 동안 약간의 신맛을 내는 경우가 많습니다.
이 식물은 전 세계적으로 채소 및 약초로 사용됩니다[17]. 잎과 씨앗은 각각 뱀과 전갈 독의 해독제로 사용됩니다[17]. 민간 요법에서 R. vicarious는 오랫동안 간 질환, 소화 불량, 변비, 치질, 구토, 헛배부름, 심장병, 통증, 비장 장애, 소화 불량, 치통, 기관지염, 천식, 옴, 백반증 및 완하제, 위약, 전채, 강장제, 이뇨제 및 진통제 [18]. 이 식물은 항산화제, 항균제, 항암제로 잘 알려진 플라보노이드, 안트라퀴논, 카로티노이드, 비타민, 지질 및 유기산을 포함한 수많은 생물학적으로 중요한 화합물을 포함합니다[19]. 이 식물의 모든 부분에는 높은 양의 케르세틴(플라보노이드)이 포함되어 있습니다[15]. 이 식물은 건조 중량 100g당 0비타민 A 0.25mg, 비타민 C 1.33mg, 비타민 E 2.37mg[15], 플라보노이드 3.38mg 및 폴리페놀 5.66mg[20]을 함유하고 있습니다.
Shahat과 동료 [21]는 쥐 모델에서 간세포 암종에 대한 R. vicarious 공중 부분의 메탄올 (80 %) 추출물의 항 혈관 신생 및 항 증식 효과를 보여주었습니다. 또 다른 연구에서는 R. vicarious 추출물의 시험관 내 항혈관신생 가능성을 보여주었습니다[22]. 전체 R. vicarious의 메탄올 추출물은 생체 내에서 사염화탄소로 유발된 간독성에 대한 보호를 나타냅니다[23]. 토끼의 항염증 효과는 R. vicarious의 메탄올성 잎 추출물에 의해 분명합니다[24]. 최근 연구[25]에서는 분획된 에탄올성 R. 대리 추출물이 겐타마이신 및 중크롬산칼륨 독성에 대한 생체 내 신장 보호 효과를 보고했습니다.
위의 정보를 고려하여 동물 모델에서 NQO1 유전자 발현을 유지함으로써 시스플라틴에 의한 신독성 회복 측면에서 대추 추출물(RVE)의 효과를 조사하는 것을 목표로 하였다.
cistanche 건강상의 이점: 신장 질환 치료
재료 및 방법
화학물질 및 시약
시스플라틴 및 2, 2-디페닐{2}}피크릴히드라질(DPPH)은 SIGMA-ALDRICH(미국)에서 구입했습니다.
크레아티닌 비색 분석 키트(제품 ID – 700,460)는 Cayman Chemical(미국)에서 구입했습니다. Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 태아 소 혈청(FBS) 및 항생제(10,{3}} U/mL 페니실린 및 10,{5}} ug/mL 스트렙토마이신)는 Gibco(Gibco Laboratories, 미국). ROS-Glo™ H2O2 분석 키트 및 GoTaq® qPCR 마스터 믹스는 Promega(미국)에서 구입했습니다. 역전사 키트 TIAN-Script M-MLV는 TIANGEN(중국)에서, 프라이머는 IDT(Integrated DNA Technologies, Malaysia)에서 구입했습니다. 이 실험에 사용된 다른 모든 화학물질과 시약은 분석 등급이었습니다.
식물 샘플 수집 및 추출물 준비
신선한 R. 대리 식물은 방글라데시 라즈샤히의 소나디기에 있는 현지 시장에서 구입했습니다. 식물 표본은 방글라데시 라즈샤히 대학교 식물학과 Dr. Ahmad Humayan Kabir에 의해 확인 및 인증되었습니다. 바우처 번호 아래의 견본 00095는 Rajshahi 대학교 식물학과 식물 표본관에 보관되었습니다. 식물의 기공 부분을 세척하고 37도에서 건조시키고 전자 건조기를 사용하여 거친 가루로 분쇄하여 4도의 밀폐 용기에 보관하였다. 미세 분말(10g)을 메탄올(500mL)에 용해시켰다. 내용물을 20kHz에서 10분 동안 초음파 처리(Soniprep 150, China)했습니다. 추출물의 여과는 DURAN Filtering Apparatus(German)와 함께 Glass Fiber Filter paper(Macherey NAGEL, GmBH, German)를 사용하여 수행되었습니다. 마지막으로, 여액을 동결건조기(VirTis Benchtop Pro, SP SCIENTIFIC, USA)를 사용하여 농축하였다. 추출물은 최종적으로 RVE로 명명되었습니다.
체외 항산화 활성 시험
RVE의 시험관 내 항산화 능력은 이전에 [26]에 기술된 바와 같이 거의 수정 없이 DPPH의 소거를 기반으로 수행되었습니다. RVE의 DPPH 라디칼 소거능은 DPPH의 보라색을 노란색으로 변환하여 평가하였다. 각 마이크로 원심분리기 튜브(2mL)의 반응 혼합물은 DPPH 라디칼(0.1mM)의 95{5}} μL 메탄올 용액과 5가지 농도(200, 500, 1000, 2000, 4000 ug)의 50 μL RVE로 구성되었습니다. /mL 메탄올)을 사용하여 10, 25, 50, 100 및 200ug/mL의 최종 농도를 만듭니다. 50 μL 메탄올 및 950 μL DPPH 메탄올 용액을 포함하는 다른 튜브를 대조군으로 유지했습니다. 시험관을 어두운 곳에 30분 동안 방치하였다. 혼합물의 흡광도는 GENESYS 10S UV-VIS 분광광도계(Thermo SCIENTIFIC, USA)를 사용하여 517 nm에서 측정했습니다. 마지막으로 라디칼 소거 활성(RSA)의 백분율은 다음 공식을 사용하여 DPPH의 변색을 기반으로 계산되었습니다. (대조군) 및 ARVE는 RVE 용액의 흡광도입니다. RVE가 50% RSA를 초래하는 농도를 IC50 값이라고 하며 사용된 다른 RVE 농도에 대한 RSA 백분율을 배치하는 그래프를 사용하여 계산했습니다.
실험동물 및 실험설계
생후 42일된 수컷 Swiss Albino 생쥐(체중 30-32g)를 방(약 25±2도의 온도 및 ~50% 습도, 12시간 암/광 주기)에서 실험을 시작하기 전에 1주일 동안 순응시켰다. 식수와 음식은 임의로 제공되었습니다.
마우스를 무작위로 8개 그룹(n {{0}})으로 분리했습니다. 첫 번째(대조군) 그룹은 0.2mL의 0.9% NaCl로 처리했습니다. 다음 4개 그룹은 24시간 간격으로 5일 동안 2.5mg/kg의 시스플라틴으로 치료했습니다. 시스플라틴 투여 후, 한 그룹(두 번째 그룹)은 추가 치료 없이 남겨두고 스트레스를 받은 대조군으로 지정되었습니다. 세 번째, 네 번째 및 다섯 번째 그룹에는 각각 25, 50 및 100 mg/kg의 RVE를 5일 동안 추가 처리했습니다. 추가로 3개의 그룹은 5일 동안 각각 25, 50 및 100mg/kg의 RVE만 처리했습니다. 시스플라틴과 RVE를 증류수에 용해시켰다. 모든 치료는 복강 내로 제공되었습니다. 마지막 치료 24시간 후, 동물은 경추 탈구 후 안락사되었습니다[25]. 그런 다음 가위로 복막을 열고 심장 천자 후 혈액을 채취하고 집게를 사용하여 신장을 채취했습니다. 혈청 내 크레아티닌 수치를 확인하기 위해 혈액을 채취했습니다. 신장은 말론디알데히드 수준과 유전자 발현을 평가했습니다.
혈청 크레아티닌 측정
혈청 크레아티닌은 Creatinine Colorimetric Assay Kit{0}},460(Cayman Chemical, USA)을 사용하여 키트와 함께 제공된 제조업체의 프로토콜에 따라 측정되었습니다.
신장 지질 과산화 측정
Malondialdehyde(MDA)는 신장 조직에서 지질 과산화의 최종 산물이며 일반적으로 ROS 생성의 지표로 측정됩니다. 그러나 MDA 수준은 선행 연구에 따라 신장 조직에서 측정되었다[27]. 먼저, 신장 조직을 인산나트륨 완충액(0.1 M, pH 7.4)에서 균질화하였다. 0.8% 티오바르비투르산(1.5mL), 8.1% SDS(200μL), 20%(pH 3.5) 아세트산(1.5mL) 및 dH2O(600μL)를 포함하는 반응 용액을 100에 첨가했습니다. 균질화된 조직 ㎕, 그리고 혼합물을 95도에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 냉각 후, 혼합물을 4도에서 10분 동안 10,{24}} g에서 원심분리하고 상청액의 흡광도를 표준 1, 1, 3, 3- 테트라 메톡시 프로판으로 532 nm에서 측정했습니다. 총 단백질량은 Bradford Protein Assay kit(BIO-RAD, USA)를 사용하여 표준 소혈청알부민(BSA)과 비교하여 측정하였다. 지질 과산화물의 강도는 단백질 밀리그램(mg)당 MDA의 나노몰(nM)로 표시됩니다.
실시간 중합효소연쇄반응(실시간 PCR)
Real-time PCR은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다[28, 29]. 제조사에서 제공한 프로토콜에 따라 TRIzol® 시약(Invitrogen)을 사용하여 신장 조직의 총 RNA를 분리했습니다. 그런 다음 분리된 RNA(1ug)를 cDNA로 전환했습니다. 먼저, 2μL 랜덤 헥사머(10μM), 2μL dNTP(10mM), 1ug RNA 및 최대 15μL의 뉴클레아제가 없는 H2O를 취하고 70도에서 5분 동안 인큐베이션했습니다. 혼합물을 즉시 얼음 위에 2분 동안 두었다. 그런 다음 4 μL의 첫 번째 가닥 완충액(5x)과 1 μL M-MLV 역전사효소를 각 튜브에 첨가하고 10분 및 50분 동안 인큐베이션했습니다.
각각 25도 및 42도에서 최소. 마지막으로, 혼합물을 95도에서 5분 동안 인큐베이션하여 M-MLV 역전사 효소를 불활성화시켰다. 합성된 cDNA 산물은 특정 프라이머를 사용하여 NQO1, p53 및 Bcl{9}} 유전자 발현의 정량을 위해 실시간 PCR을 수행했습니다(표 1). 각 반응(1{14}}μL)은 5μL GoTaq qPCR Master Mix(2x)(Promega, USA), 0.5μL(10mM)의 각 프라이머, 3μL 뉴클레아제가 없는 물, 및 1 μL cDNA를 48-웰 반응 플레이트에 넣습니다. 열 사이클링은 실시간 PCR 기계(Eco™ Real-Time PCR System, Illumine®, USA)를 사용하여 다음과 같은 사이클링 조건으로 수행되었습니다. 30초 동안 50도, 25초 동안 72도. PCR 반응의 특이성은 95도에서 15초, 45도에서 15초, 95도에서 15초 동안 용융 곡선을 분석하여 확인했습니다. PCR 반응의 특이성은 95도에서 15초, 45도에서 15초, 95도에서 15초 동안 용융 곡선을 분석하여 확인했습니다. ΔΔCq 방법을 기반으로 내인성 GAPDH 유전자를 대조군으로 사용하여 유전자 발현의 상대적 정량화를 수행하였다.
세포 배양 및 치료
인간 신장 근위 세뇨관 상피 세포주인 HK{0}} 세포를 10% FBS 및 항생제(50U/mL 페니실린 및 50ug/mL 스트렙토마이신)가 보충된 DMEM에서 5% CO2 및 95%가 있는 인큐베이터에서 유지했습니다. 37도에서 퍼센트 습도 .
H2O2 측정 분석
HK-2 세포의 H2O2 수준은 키트 제조업체에서 제공한 프로토콜에 따라 ROS-Glo™ H2O2 Assay 키트(Promega, USA)를 사용하여 추정되었습니다. 70 μL DMEM의 HK-2 세포(1000개 세포)를 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 넣었습니다. 세포를 벽면에 부착시킨 후, 마이크로타이터 플레이트의 웰로부터 10 μL DMEM을 10 μL 시스플라틴(DMEM에서 25 μM)으로 교체하고 인큐베이터에서 12시간 동안 보관하였다. 그런 다음, 10 μL RVE를 첨가하여 DMEM에서 최종 농도 125, 250 및 500 ug/mL를 만들고 추가 12시간 동안 인큐베이션했습니다. 그 후, 20 μL H2O2 기질 용액과 100 μL ROS-Glo™ 검출 용액을 각 웰에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로 GloMax Luminometer(Promega, USA)를 이용하여 발광성을 측정하였다.
GC-MS 분석
RVE(메탄올에 용해됨)의 GC-MS 분석은 자동 샘플러(AOC{ {5}}s), 자동 주입기(AOC-20i) 및 SH-Rxi{{1{{ 37}}}}Sil MS 모세관 컬럼(3{41}} m × 0.25μm ID × 0.25μm DF). 캐리어 가스 Helium은 1.72 mL/min의 일정한 유속으로 유지되었고, 5 μL의 주입 부피는 10:1 분할 비율로 처리되었습니다. 인젝터의 온도는 220도, 이온 소스 온도는 280도, 오븐 온도는 80도(2분 유지)에서 5도/분의 증가로 150도(유지 시간 5.0 분), 280도까지 5도/분, 280도에서 8분 등온으로 끝남. 질량 스펙트럼은 0.5초의 스캔 간격으로 1.5kV에서 취했으며 샘플은 45–350m/z 범위에서 실행되었습니다. 용매 지연은 0~3분이었고 총 GC-MS 실행 시간은 55분이었습니다. 검출된 화합물의 상대 농도는 평균 피크 면적을 전체 면적과 비교하여 측정되었습니다. GC-MS의 질량 스펙트럼 해석은 NIST08, NIST08 및 NIST14를 포함한 NIST(National Institute Standard and Technology) 데이터베이스를 사용하여 수행되었습니다.
통계 분석
통계 분석은 IBM SPPS(버전 20) 소프트웨어를 사용하여 Dunnett의 T3 테스트에 따라 ANOVA에 의해 수행되었습니다. 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시됩니다. 유의미한 비교는 p에서 고려되었습니다.<0.05. all="" of="" the="" graphs="" were="" prepared="" using="" microsoft="" excel="" (version="">
결과
체외 항산화 활성 시험
이전에 RVE가 항산화 활성을 갖는 것으로 보고되었지만 DPPH 자유 라디칼 소거능을 사용하여 추출물의 항산화 활성을 다시 확인했습니다. RVE는 용량 의존적으로 DPPH를 중화시켰다(그림 1). RVE는 상당한 시험관내 항산화 활성을 나타내었고 RVE의 계산된 IC50 값은 37.39 ± 1.89 ug/mL였습니다.
혈청 크레아티닌 측정
쥐의 혈청 크레아티닌 수준은 시스플라틴 투여 후 유의하게(p<{0}}.05) 증가했습니다(표="" 2).="" rve를="" 사용한="" 치료(p="">< 0.05)는="" 용량="" 의존적="" 방식으로="" 크레아티닌="" 수치를="" 개선했습니다(표="">
신장 지질 과산화 측정
대조군과 비교하여 시스플라틴은 마우스의 신장 조직에서 MDA 함량을 상당히 증가시켰습니다(p < {0}}.05)(표="" 3).="" 대조적으로,="" rve="" 치료는="" 용량="" 의존적="" 방식으로="" mda를="" 거의="" 정상으로="" 상당히(p="">< 0.05)="" 회복시켰다(표="">
실시간 PCR
시스플라틴은 유의하게(p < {0}}.{11}}5)="" nqo1="" mrna="" 발현을="" 0.{4}}배="" 감소시키고="" p53="" 및="" bcl-2="" mrna를="" 증가시켰습니다.="" 식을="" 각각="" 24와="" 4.{9}}접습니다(그림="" 2).="" rve는="" 상당히(p="">< 0.05)="" nqo1,="" p53="" 및="" bcl{15}}="" mrna="" 발현을="" 용량="" 의존적="" 방식으로="" 완화했습니다(그림="" 2).="" 유일한="" 시스플라틴="" 처리군과="" 비교하여="" nqo1="" mrna="" 발현은="" 3.57,="" 6.36,="" 9.{25}}25,="" 50="" 및="" 100배="" 증가했습니다.="" mg/kg="" rve(그림="" 2a).="" 다시,="" p53="" mrna="" 발현은="" 25,="" 50="" 및="" 100="" mg/kg="" rve에서="" 각각="" 0.63,="" 0.46="" 및="" 0.{36}}배="" 감소했습니다(그림="" 2b).="" bcl{41}}="" mrna="" 발현도="" 각각="" 25,="" 50,="" 100="" mg/kg="" rve에서="" 0.71,="" 0.40,="" 0.{47}}배="" 감소했습니다(그림="" 2c).="" 그러나="" rve="" 처리로="" 인한="" nqo1,="" p53="" 및="" bcl{56}}="" 유전자의="" 발현="" 수준에서는="" 유의한(p=""> 0.05) 변화가 발견되지 않았습니다(그림 3).
H2O2측정 분석
H2O2 측정 분석에서 H2O2레벨은 발광에 비례하는 것으로 간주되었다. 시스플라틴을 투여하면(p < {{0}}.05)="" h2o2="" 수준이="" 2.2-배="" 증가했습니다(그림="" 4).="" rve="" 처리는="" 상당히="" 감소했습니다(p="">< 0.{15}}5)="" h2o2="" 수준은="" 125,="" 250="" 및="" 500ug/ml에서="" 각각="" 0.25,="" 0.38,="" 0.{16}}배="">
GC-MS 분석
"Isoborneol, pentamethyldisilanyl ether(sesquiterpene alcohol)", "Thymine(pyrimidine nucleobase)", "4H-Pyran{6}}one, 2,{{ 8}}디히드로-3,{10}}디히드록시{11}}메틸-(사포닌)", "헥사데칸산, 메틸 에스테르(지방산 메틸 에스테르)", "9,{14}} 옥타데카디엔산, 메틸 에스테르(지방산 메틸 에스테르)", "9-옥타데센산(Z)-, 메틸 에스테르(지방산 메틸 에스테르)", "메틸 스테아레이트(지방산 메틸 에스테르)", "디이소옥틸 프탈레이트 (에스테르)", "13-도코센아미드, (Z)-(알칼로이드)" 및 "스쿠알렌(트리테르펜)"이 RVE에서 검출되었습니다.
cistanche tubolosa의 이점: 혈중 지질 감소
논의
천연 및 합성 항산화제가 종합적으로 연구되었으며 동물 생리학에서 독성을 예방하거나 개선하는 기능이 있는 것으로 밝혀졌습니다[31]. 항산화 보충제는 화학적 합성 또는 자연 식품에서 추출하여 개발된 성분이지만 식품에서 사용 가능한 항산화제와 구성이 동일하지 않습니다[5]. 따라서 합성 항산화제가 천연 항산화제와 유사한 건강상의 이점을 제공하는지 여부에 대한 의견은 시간이 지남에 따라 분리됩니다[32]. 합성 항산화 보충제의 사용을 줄이고, 저렴하고, 재생 가능하고, 자연적이며, 효과적인 천연 항산화제의 안전한 공급원을 찾고자 하는 충동이 일어나고 있습니다.
가장 중요한 메커니즘 중 하나는 외인성 또는 내인성 스트레스 요인에 의해 유발된 산화 스트레스로부터 세포를 일반적으로 보호하는 핵 인자 적혈구계 관련 인자{1}}(Nrf2) 경로입니다[27]. 효과적인 항산화제는 Nrf2의 발현을 유도하며, 이는 핵으로 더 이동하여 2상 해독 및 항산화 유전자 NQO1의 발현을 유발하는 항산화제 반응 요소(ARE)에 결합합니다[33, 34]. NQO1은 조직 특이적 방식으로 광범위하고 차등적으로 발현됩니다. NQO1은 세포질 항산화 플라보단백질로 퀴논에서 하이드로퀴논으로의 전자 환원을 2-촉매하여 친전자체를 해독하고 산화환원 순환을 예상합니다[35]. 이전 연구[36]에 따르면, -lapachone은 NQO1을 활성화하여 세포 내 NAD 플러스 수준을 추가로 증가시키고 시스플라틴에 의해 유발된 급성 손상으로부터 신장을 보호합니다.
시스플라틴은 산화 스트레스, 염증 및 세포자멸사를 통해 사구체 여과막의 손상을 유도하여 사구체 여과율을 감소시키고 정상적인 막 투과성을 상실시키는 것으로 알려져 있습니다[37]. 따라서 혈청 크레아티닌 수치가 증가했습니다. 혈청 크레아티닌은 잠재적인 신장 기능 마커 중 하나입니다. 시스플라틴 치료는 지질 과산화의 2차 산물인 신장 조직의 MDA 함량을 증가시켰으며 이 보고서는 이전 연구와 동일합니다[27, 35, 37, 38]. RVE를 사용한 치료는 신장 조직에서 MDA 함량을 상당히 감소시켰습니다. 동시에 크레아티닌 수치도 감소하여 RVE의 개선 효과를 나타냅니다.
또한 NQO1 발현은 cisplatin 노출 후 유의하게 감소하였고 p53과 Bcl{2}} 발현은 유의하게 증가하였다. 생체 내 NQO1 및 p53 발현 측면에서 우리의 결과는 이전 연구[13]와 일치합니다. 최근 연구[39]에 따르면 시스플라틴은 쥐의 신장에서 Bcl{7}}의 발현을 유의하게 감소시켰지만 놀랍게도 우리는 증가된 발현을 발견했습니다. 이 차이는 Mohamed와 동료들[39]이 12일 동안 8mg/kg을 사용한 반면 우리는 5일 동안만 2.5mg/kg을 사용했기 때문에 용량 차이[40]의 결과일 수 있습니다. 또 다른 연구[41]에서는 시스플라틴이 비세포독성일 때 용량에서 Bcl{16}}의 발현을 증가시킬 수 있다고 밝혔습니다. 다시 말하지만, 증가된 Bcl{18}} 발현은 세포를 산화 스트레스에 민감하게 만듭니다[40].
그러나 p53의 발현은 정상적인 생리적 조건에서는 낮으나 cisplatin을 투여하면 p53 의존적 세포자멸사 경로를 활성화시켜 상향조절될 것으로 기대된다. 쥐를 시스플라틴으로 처리하면 대조군에 비해 쥐의 신장에서 p53이 유의하게 증가했습니다. 또 다른 원발암유전자 Bcl-2도 NQO1 발현 수준과 상관관계가 있습니다. p53 발현을 모방하여 우리는 또한 Bcl{9}} 수치가 시스플라틴 처리로 증가했지만 RVE 처리 시 유의하게 회복되었음을 발견했습니다. 이것은 산화 스트레스에 대한 반응으로 p53 유전자가 활성화되어 세포주기, 노화 또는 세포 사멸을 억제하는 결과가 가능합니다 [6]. 해독과 함께 NQO1 과발현은 종종 암세포의 세포사멸과 상관관계가 있는 것으로 간주되지만[10], 세포사멸의 기본 메커니즘과 NQO1의 과발현은 여전히 논란의 여지가 있습니다. 또한 간세포 암종에서 NQO1 과발현은 Bcl{18}} 발현을 감소시킵니다[10]. 원종양유전자 Bcl{21}}도 NQO1 발현과의 상관관계처럼 p53을 가지고 있습니다. p53은 다양한 유형의 세포 스트레스에 의해 활성화되는 서열 특이적 전사 인자인 반면[42], Bcl{27}} 과발현은 산화 스트레스 시 시토크롬-c 방출을 촉진하는 미토콘드리아 기공 안정화제 역할을 합니다[12]. 우리의 경우 정상 신장 조직에서 시스플라틴 처리로 두 유전자 반응을 모두 확인하고 증가된 발현을 발견했습니다. RVE 처리는 용량 의존적 방식으로 p53 및 Bcl{32}}의 발현을 거의 정상으로 되돌렸습니다. 이러한 유형의 Bcl-2 표현식 폐기는 ROS 스캐빈저 Trolox를 사용하여 표시되기도 했습니다[43]. 또한, H2O2 수준은 시험관 내 시스플라틴 처리로 인해 HK{38}} 세포에서도 현저하게 증가했습니다. RVE 치료 후 H2O2 수치는 정상 수준으로 크게 회복되었습니다. 이것은 산화 스트레스에 대한 보호를 발휘하는 NQO1 발현[44]을 증가시키는 RVE 처리의 효과 때문일 수 있습니다[6].
GC-MS 크로마토그램은 RVE에 10가지 화합물의 존재를 확인했습니다. 이 중 "4H-Pyran- 4-one, 2, 3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-", "Hexadecanoic acid" 및 " 스쿠알렌"은 잘 알려진 항산화제입니다[45-47]. 이 세 가지 화합물은 모두 시너지적 신장 보호 효과를 발휘했을 가능성이 있습니다. 이전 연구에서는 비타민 A[48], 비타민 C[49], 비타민 E[50], 플라보노이드[51], 폴리페놀[50]에 의한 NQO1 발현 유도에 대해서도 보고했습니다. 따라서 이 보고서는 이 특정 추출물에 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E, 플라보노이드, 폴리페놀 중 어떤 것이 포함되어 있는지 여부를 밝히고 있습니다.
결론
전반적인 발견은 RVE가 시스플라틴으로 인한 손상으로부터 신장을 보호하는 데 생리학적으로 효과적임을 시사합니다. 따라서 인체 적용에 도움이 될 수 있는 시스플라틴 유도 신독성을 완화하는 정확한 화합물을 밝히는 것이 중요합니다.
감사의 말
저자는 RNA를 정량화하기 위한 실험실 지원을 제공한 Rajshahi Branch의 방글라데시 과학 및 산업 연구 위원회(BCSIR)에 감사드립니다.
저자의 기여
MMH는 실험 설계, 실험, 데이터 분석 및 준비, 원고 작성 및 편집, 원고 수정 및 초안 작성을 수행했습니다. MST 및 MME는 실험 및 데이터 분석을 완료했습니다. AME & MAR은 감독 및 자원에 기여했습니다. AH는 개념화, 감독, 리소스 및 원고 편집을 담당했습니다. 모든 저자
원고를 검토했다. 저자는 최종 원고를 읽고 승인했습니다.
자금 조달
현재 작업은 사우디 아라비아의 타이프에 있는 타이프 대학교의 프로젝트 번호(TURSP - 2020/75)를 지원하는 타이프 대학교 연구원의 자금 지원을 받았습니다.
데이터 및 자료의 가용성.
모든 관련 데이터를 사용할 수 있으며 요청 시 교신저자에게 제공할 수 있습니다.
선언
윤리 승인 및 참여 동의
이 실험을 수행하기 위한 윤리는 기관 동물, 의료 윤리, 생물안전 및 생물보안 위원회(IAMEBBC), 생물 과학 연구소(IBSc), Rajshahi 대학교의 승인을 받았으며 메모 번호 31/{{1} }IAMBBC/IBSC. 모든 방법은 위에서 언급한 윤리위원회에서 제공한 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다. 이 연구는 ARRIVE(Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) 지침에 따라 수행되었습니다. "참여 동의"는 이 연구에 적용되지 않습니다.
작성자 세부정보
1 분자 생물학 및 단백질 과학 연구실, 유전 공학 및 생명 공학과, 생명 및 지구 과학 학부, Rajshahi 대학, Rajshahi 6205, 방글라데시. 2방글라데시 Rajshahi 6205 Rajshahi 대학교 생물학 연구소 분자 병리학 연구실. 3Taif University 이과대학 생명공학과, PO Box 11099, Taif 21944, Saudi Arabia. 4 이집트 알렉산드리아 21545 알렉산드리아 대학교 농업부 유전학과.
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