재생 의학은 최근 신흥 분야로 발전했습니다

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추상적인:우리는 이전에 c-KIT와 htaman 양수 유래 줄기 세포가 일상적인 임신 2기 산전 진단(태아 hAFS)의 남은 샘플로부터 생존, 항섬유화 및 증식 효과를 유도하는 재생 측분비 잠재력을 부여받았다고 보고했습니다. 또한 예정된 제왕절개술(주산기 hAFS) 동안 III 삼분기 임상 폐기물 샘플에서 분리될 수 있으므로 태아 hAFS와 비교할 때 더 쉽게 접근할 수 있는 대안을 제공합니다. 그럼에도 불구하고, 주산기 hAFS의 측분비 프로파일에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 여기에서 우리는 hAFS 총 분비체(즉, 조절 배지, hAFS-CM에서 세포에 의해 방출되는 가용성 측분비 인자의 전체) 및 세포외 소포( hAFS-EVs), Ⅱ삼분기 태아 대 III 삼분기 주산기 세포에서. 태아 및 주산기 hAFS를 특성화하고 측분비 잠재력을 향상시키기 위해 저산소 조건을 적용했습니다. hAFS-CM 및 hAFS-EV 제형은 단백질 및 케모카인/사이토카인 함량에 대해 분석되었고 EV 화물은 RNA 시퀀싱에 의해 추가로 조사되었습니다. 태아 및 주산기 hAFS의 표현형은 해당하는 분비체 제형과 함께 중첩되었습니다. 그러나, 태아 hAFS는 주산기에 비해 미성숙한 산화적 인산화 활성을 보였다. 측분비 화물의 프로파일링은 임신 단계와 저산소 조건에 따라 약간의 차이가 있음을 보여주었습니다. 두 세포 소스 모두 신경영양, 면역조절, 항섬유화 및 내피 자극 인자가 풍부한 제형을 제공했으며, 미성숙 태아 hAFS 분비체는 보다 확연한 혈관형성, 재생, 해결 및 노화 방지 프로파일로 정의되었습니다. 작은 RNA 프로파일링은 태아 및 주산기 hAFS-EV 화물 모두에서 microRNA 농축을 보여주었고, 참조 분자 서명으로 안정적으로 발현된 프로 해결 코어를 사용했습니다. 여기서 우리는 hAFS가 재생 측분비 인자의 매력적인 원천임을 확인합니다. 미래 측분비 요법을 위한 태아 또는 주산기 hAFS secretome 제제의 선택은 특정 임상 시나리오를 고려하여 평가되어야 합니다.

키워드:양수; 줄기 세포; 측분비 효과; 세포외 소포; 세포 조절 배지; 케모카인; 사이토카인; 단백질체학; RNA 시퀀싱; 마이크로RNA

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1. 소개

재생 의학은 최근 몇 가지 전략을 통해 손상된 조직의 기능적 복원을 제공하는 신흥 분야로 발전했습니다. 최근 몇 년 동안 조직 공학 접근 방식이 크게 발전함에 따라 줄기 세포 측분비 효과에 대한 연구가 점점 더 강화되었습니다. 이식된 줄기 세포의 치료 가능성은 기능 회복의 내인성 기전의 활성화를 촉발하는 동시에 숙주 조직에서 재생을 촉진하는 미세 환경을 조율할 수 있는 분비된 용해성 인자에 의해 대부분 매개되는 것으로 광범위하게 나타났습니다[1,2]. 따라서 줄기 세포는 세포에서 방출되는 측분비 영양 분자 전체와 막 결합 세포외 소포체를 분비하는 것으로 심혈관, 신경 및/또는 염증을 대상으로 하는 여러 독립적인 전임상 연구에 의해 혁신적인 치료 의약품으로 점점 더 제안되고 있습니다. 질병. 따라서 줄기 세포는 즉시 사용 가능하고 기성품 재생 치료를 제공함으로써 치료 분비체를 개발하기 위한 생물학적 공장으로 생각할 수 있습니다. 이러한 세포 기반의 무세포 전략을 적용하면 표준 세포 치료와 관련된 많은 제한적인 측면을 극복하면서 여전히 유익한 효과를 얻을 수 있습니다.시스탄체란 무엇인가이러한 관점에서 중간엽 기질 세포(MSC)는 추정 세포 후보로 광범위하게 테스트되었습니다. 실제로, MSC 및 줄기/전구 세포는 분비된 세포외 소포(EV)의 생물학적 관련성에 대한 명시적인 관심과 함께 재생 능력과 분비 잠재력을 향상시키기 위해 다양한 사전 조건화 전략에 의해 조작 및/또는 자극되었습니다.

EV는 지질 이중층으로 구분되는 나노 크기의 입자이며 모든 세포 유형에서 활발히 분비됩니다. EV에는 매우 작은(<200 nm)="" exosomes,="" medium-sized="" (200-500="" nm)microvesicles="" or="" shedding="" vesicles,="" and="" larger-sized="" apoptotic="" bodies="" (="">500nm); 그들은 모세포에서 반응자/표적 세포로 분자 화물을 전달함으로써 세포간 신호의 중요한 생물학적 컨베이어로 작동합니다[5,6]. 유익한 효과를 발휘하는 독특한 측분비 잠재력이 기원 세포와 비슷하다는 점을 감안할 때, 줄기 세포 EV는 [{{3 }}]. 번역 관점에서 보면 세포 조절 잠재력 외에도 격리 가능성 및 자가 재생의 증가는 치료 EV 및 용해성 인자의 이상적인 소스의 핵심 측면입니다. 이러한 시나리오에서 태아 및 주산기 MSC는 증식 가능성과 배아 및 성인 체세포 전구체 사이의 중간 기능을 가진 발달 미성숙 프로필을 고려할 때 흥미로운 옵션을 제공할 수 있습니다[10,11]. 태아 MSC는 태아 선별 검사(즉, 융모막 융모[{10}}] 및 양수[15,16]) 동안 얻은 잔여 표본으로 또는 출생 시 주산기 선조체로 획득하여 임신 중 배아 외 부속물에서 분리할 수 있습니다. 임상 폐기물(즉, 양막 및 태반[{13}}], 탯줄 구성요소[22-24] 및 기간 양수[25,26])에서 발생합니다.

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특히, 인간 양수 줄기 세포(hAFS)는 재생 의학에서 유망한 치료 전략으로 강조되었습니다. 시험관 내 및 생체 내에서 광범위하게 다능성이 있는 것으로 나타났으며[16,27,28], 자궁 내 이식 후 조혈 계통에 기여하고[29], 면역 조절 효과[26,30] 및 활성을 발휘하면서 손상된 장기에 이식됩니다. [31]에 포괄적으로 설명된 내인성 수복 반응. 우리 팀과 다른 사람들은 hAFS가 다양한 회복 메커니즘을 표적으로 삼을 수 있는 생리활성 영양 분자가 매우 풍부한 분비체를 방출한다는 것을 추가로 입증했습니다. hAFS 측분비 인자는 염증을 억제하는 생존 자극을 제공하고[32], 장기간 허혈[33.34] 및 심장독성[35]에 대한 심장 보호를 제공하고, 심근 세포 주기 재진입으로 국소 혈관신생을 자극하는 것으로 보고되었습니다[32]. 34,36]. 이러한 효과의 대부분은 hAFS-EV 단독 투여에 의해 요약된 것으로 나타났으므로, 독립적인 연구는 골격 및 심장 근육 손상, 신장 질환, 골관절염, 골다공증, 괴사성 장염 및 신경퇴행성을 비롯한 다양한 병리학적 배경에 대해 재생 프로파일을 분석하는 데 초점을 맞췄습니다. 모델 [34,{18}}].

증거가 미래 측분비 요법을 위한 hAFS-EV의 임상적 번역을 뒷받침할 수 있지만, 이러한 연구의 대부분이 임신 2기 산전 선별 검사 동안 얻은 태아 hAFS의 조절 가능성을 주로 조사했다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. 주산기의 상대편(즉, III 삼분기 제왕절개 부분)은 아직 자세히 조사되지 않았습니다. 임신 3기 주산기 hAFS는 임신 2기 및 임신 2기에 비해 독특한 면역 조절 특성을 나타내면서도 적절한 내피 재생 잠재력을 유지합니다[25].얼마나 많은 cistanche를 복용참고로, 태아 hAFS의 이질적인 형태에 대한 최근 보고서[45]는 그들의 줄기와 유전자 발현 프로필에 대한 새로운 통찰력을 제공했습니다.바이오플라보노이드이것은 hAFS[46]의 다른 세포 분획의 재생 가치에 대해 완전히 새로운 빛을 주었습니다. 따라서, hAFS의 다양한 하위 집단에 대한 포괄적인 특성화가 주목을 받고 있습니다. 우리는 이전에 24시간 저산소 및 무혈청 자극이 2기 태아 hAFS의 측분비 전위를 높이는 효과적인 전략임을 보고했습니다[34,35,37]. 임신 III기 hAFS의 secretome 구성에 대해 알려진 바가 거의 없기 때문에, 여기에서는 임신 단계와 저산소 세포의 영향을 다루기 위해 II 대 III 임신 hAFS와 이들의 secretome fractions(모자-EV 포함)의 포괄적인 비교를 보고합니다. 세포 및 secretome 특성에 대한 전제 조건.

2. 결과

2.1.주산기 hAFS는 태아에 가까운 표현형 일치를 나타냄

태아 II 삼 분기와 주산기 III 삼 분기 양수 샘플 사이의 기증자 연령에서 통계적으로 유의미한 차이가 인정되지 않았습니다. 태아 c-KIT* hAFS(II 삼분기 양수 샘플의 f-hAFS) 및 주산기 c-KIT* hAFS(III 삼분기 양수 임상 폐기물의 p-hAFS)는 섬유아세포 유사 및 타원형 원형 형태로 유사한 특징을 확인했습니다(그림 1A) 및 이전에 보고된 바와 같이 중간엽 기질 표현형(데이터는 표시되지 않음). 계대 5까지 시험관 내에서 배양된 f-hAFS와 p-hAFS는 모두 세포의 약 4%에서 노화 관련{13}}갈락토시다제(SA{14}}Gal) 활성화로 인한 노화 수준을 무시할 수 있는 수준으로 나타냈습니다(그림 1B). . f-hAFS와 p-hAFS는 모두 높은 분비성 표현형을 정의하는 것으로 최근 보고된 중간엽 마커 CD107a 및 CD146의 높은 수준의 동시 발현을 나타냅니다[47]. CD107at CD146* 세포는 f-hAFS 집단의 대부분을 나타냅니다(약 64%,*p<0.05), while="" p-hafs="" showed="" a="" lower="" enrichment="" for="" this="" subpopulation,="" approximately="" 52%="" of="" total="" cells,="" yet="" this="" disparity="" was="" not="" statistically="" significant="" (figure="">

그림 1. 태아는 표현형 평가가 있고 주산기는 있습니다. (A) 표준 조건에서 체외 배양된 태아 hAFS(f-hAFS, 왼쪽 패널) 및 주산기 hAFS(p-hAFS, 오른쪽 패널)의 대표적인 이미지; 스케일 바: 2{15}}0 음. (B) 배양에서 5회 계대 후 f-hAFS 및 p-hAFS에 대한 세포화학 염색을 통한 노화 마커 베타-갈락토시다제(SA- -Gal, 파란색)의 분석; 대표적인 이미지는 왼쪽 패널에 보고되며, 축척 막대: 200 um입니다. -Gal 양성 세포/필드의 해당 비율은 오른쪽 패널의 그래프에 보고됩니다(f-hAFS:4.12±0.58% 및 p-hAFS:3.88±2.10% ;p=0.1424,n{ {24}} 실험).(C) CD146 및 CD107a 중간엽 마커를 발현하는 hAFS의 면역표현형. f-hAFS 및 p-hAFS의 대표적인 유세포 분석 플롯(왼쪽 패널) 및 이중 양성 CD107a + CD146 + 세포를 나타내는 해당 값; CD107a + CD146* f-hAFS: 63.68±5.82%,*p=0.016잔존 대비 g36.32±5.82% f-hAFS(기타);CD107at CD146 + p-hAFS: 52.07±6.76% 93±56.76% p-hAFS(기타); CD107a + CD146 + f-hAFS vs CD107a + CD146 + p-hAFS p{63}}.2403,n{65}} 실험. 기타: 남은 CD107a-CD146~hAFS, CD107a~CD146*hAFS 및 CD107at CD{72}}hAFS의 총량. 모든 값은 독립적인 실험의 평균 ± sem으로 표시됩니다. SA{73}}Gal: 노화 관련{75}}갈락토시다제.

2.2.태아 hAFS는 주산기 hAFS와 다른 대사를 보여줍니다

임신 단계가 미토콘드리아 대사에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 평가하기 위해 f-hAFS 및 p-hAFS를 표준 시험관 배양 조건에서 생화학적 분석으로 분석했습니다. 호기성 대사의 평가는 산소 소비율(OCR)과 ATP 합성이 p-hAFS와 관련하여 f-hAFS에서 더 낮은 것으로 나타났습니다. 둘 다 피루브산과 말산으로 자극되었을 때(P/M;***p<0.001 for="" ocr,="" and=""><0001, for="" atp="" synthesis),="" and="" with=""><0.01 for="" ocr="" and="" atp="" synthesis,="" figure="" 2a).="" moreover,="" f-has="" displayed="" a="" lower="" oxidative="" phosphorylation="" efficiency="" when="" compared="" to="" p-hafs,="" as="" shown="" by="" thep/o=""><0.001 for="" p/m="" and=""><0001 for="" succinate).="" values="" for="" f-hafs="" were="" lower="" than="" those="" reported="" in="" the="" literature[48],="" and="" suggest="" uncoupling="" between="" oxygen="" consumption="" and="" atp="" production="" (figure="" 2a).="" by="" evaluating="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation,="" and="" glucose="" in="" oxidative="" phosphorylation="" (oxphos)metabolism,="" we="" noticed="" that="" f-hafs="" were="" sensitive="" to="" the="" addition="" of="" bptes="" (glutaminase="" inhibitor,**="">< 0.01)="" and="" etomoxir(carnitine="" palmitoyl-transferase="" 1a="" inhibitor,=""><0.01), but="" not="" to="" uk5099="" (mitochondrial="" pyruvate="" carrier="" inhibitor).="" by=""><0.0001)and><0.001),but not="" etomoxir,inhibited="" the="" metabolism="" of="" p-hafs="" (figure="" 2b,="" upper="" panel).="" this="" observation="" was="" confirmed="" by="" the="" inhibition="" percentage="" of="" the="" single="" inhibitor="" (figure="" 2b,="" lower="" panel).="" therefore,="" both="" cell="" types="" similarly="" rely="" on="" glutamine="" as="" a="" respiratory="" substrate;="" yet,="" f-hafs="" prefer="" fatty="" acids="" as="" a="" second="" substrate,="" while="" p-hafs="" are="" sustained="" by="" glucose.="" interestingly,="" f-hafs="" showed="" a="" higher="" increment="" of="" glucose="" consumption="" and="" lactate="" release="" when="" compared="" to="" p-hafs=""><0.05><0.001 respectively,="" figure="" 2c),="" which="" indicates="" the="" attempt="" to="" balance="" inefficient="" aerobic="" metabolism="" by="" lactate="" fermentation.="" this="" difference="" could="" also="" explain="" the="" reaction="" of="" f-hafs="" to="" the="" addition="" of="" etomoxir="" and="" uk5099.="" since="" f-has="" favor="" the="" use="" of="" glucose="" during="" anaerobic="" glycolysis(*=""><0.05), they="" are="" likely="" forced="" to="" use="" fatty="" acids="" and="" glutamine="" to="" supply="" the="" aerobic="">

2.3.저산소증 전제 조건은 태아에 영향을 미치지 않으며 주산기는 생존력이 있고 분비 활동을 유지합니다.

hAFS 세크레톰 제형을 정의하기 위해, FBS로부터의 임의의 오염을 피하기 위해 세포를 무혈청 조건에서 배양하였다. 우리는 이전에 24시간 무혈청(SF) 및 1% O2 저산소 배양 조건이 2기 태아 hAFS(f-hope)의 생존력을 유의하게 변경하지 않은 반면, 세포 조건 배지에서 재생 측분비 인자의 방출을 지원한다는 것을 보여주었습니다. (hAFS-CM) 및 세포 외 소포 (hAFS. EVs) [34,35,37,49]. 여기에서, 처음으로 p-hAFS secretome fraction을 프로파일링하는 것 외에도, 우리는 p-가 정상 산소 배양 조건을 대조군으로 사용하여 동일한 사전 조건화 체제에서 유사한 행동을 나타내는지 여부를 평가했습니다. f-hAFS 및 p-hAFS 생존율은 24시간 후 다음 설정에서 분석되었습니다. (SF f-hAFSnormo 및 SF p-hAFSnormo), 완전 대조 배지에서의 저산소 상태(1% O2)(Ctrlf-hypo 및 Ctrl p-hAFSnypo 있음) 및 SF 배지에서의 저산소 상태(SF f-hypo 및 SF p 있음) - 하이포가 있음, 그림 3A). 우리는 f-has 생존력이 Ctrl 및 SF 조건 및 저산소 자극 하에서 변경되지 않았으며 총 세포의 80% 이상(최대 거의 88%)이 영향을 받지 않음을 확인했습니다. 초기 및 후기 세포사멸 세포는 ca. 통계적으로 유의미한 관련성이 없는 SF 조건에서 13%에서 18%입니다. 유사하게, 주산기의 생존력은 80-92 퍼센트의 범위에 있었고 초기 및 후기 세포사멸 세포는 SF 조건에서 최대 18%를 나타냈습니다. p-hAFS는 결합된 저산소 및 SF 조건에서만 약간의 영향을 받았습니다. 실제로, p-hAFS가 완전 배지에서 배양될 때 사전 조건화는 세포 생존에 영향을 미치지 않았지만, 상응하는 SF 조건은 ca. 4-접기(* p<0.05) of="" late="" apoptotic="" cells(figure="">

그림 2. 태아 및 주산기hAFS의 대사 특성. (A) 산소 소비율(OCR), F1-F.ATP 합성효소를 통한 ATP 합성, 피루베이트 + 말레이트(P/M) 또는 숙시네이트 존재하의 f-have and-have의 P/O 비율 (성공);***p=0.0005,**p=0.0012,****p<><0.0001.(b)ocr and="" atp="" synthesis="" in="" presence="" of="" bptes,="" etomoxir,="" and="" uk5099(upper="" panel)="" was="" sequentially="" added="" during="" the="" experiments="" to="" evaluate="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation="" and="" glucose="" in="" oxphos="" metabolism="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.for="" ocr="" experiments:="" f-hafs+bptes**p="0.0014;for" f-hafs="" +="" etomoxir**p="0.0088;for" p-hafs=""><0.0001;for><0.0001. for="" atp="" experiments:="" f-hafs="" +="" bptes****=""><0.0001; for="" f-hafs＋etomoxir**p="0.0013;for"><0.0001;for p-hafs="" +="" uk5099="" **=""><0.0001).>시스탄체 오스트레일리아위에 표시된 억제제로 인한 f-and-hAFS의 OCR 및 ATP 합성 억제 백분율 비교는 하단 패널 B에 보고됩니다. OCR 실험의 경우: hAFS + Etomoxir**** p<0.0001; for="" hafs="" +="" uk5099="" ****=""><0.0001. for="" atp="" experiments:=""><0.0001;for hafs="" +uk5099="" ****=""><0.0001).(c) glucose="" consumption,lactate="" release="" and="" anaerobic="" glycolysis="" yield,="" used="" as="" markers="" of="" the="" anaerobic="" glycolysis,="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.="" all="" values="" are="" expressed="" as="" mean="" ±="" use.m="" of="" n="4" independent="" experiments;*p="">

그런 다음 단백질 농축을 기반으로 f-hAFS 대 p-hAFS에서 얻은 secretome fraction의 수율을 평가했습니다. 세포 분비 측분비 인자의 전체가 여기에서 hAFS-CM으로 표시되기 때문에 전체는 secretome을 갖는다. 저산소 세포 전처리 후 SF 배지에서 f-hAFS-CM 및 p-hAFS-CM의 단백질 농도 대 대조군 정상 산소 조건을 기준선으로(즉, f-hAFS-CMnormo, f-hAFS-CMNypo, P has-CMnormo 및 p -hAFS-CMHypo)를 BCA 분석으로 평가하고 10§ 세포에 따라 측정했습니다.시스탕획득한 결과는 f-has-CM과 p-hAFS-CM이 저산소 프라이밍(f-hAFS-CMnypo'166.10±22.13 ug/10 도 세포;p-hAFS-CMNypo∶182.30±29.71 ug/1{72}}도 세포) 정상 산소 세포(f-hAFS-CMnormo:105.50±19.89 ug/10도 세포, p- hAFS-CMhypoi 91.12±24.39 ug/10 degree cells) 이와 유사하게 hAFS-EV의 표면 단백질 농도는 f-have-EVSnormo, f-hAFS-EVShypo, p-hAFS-EVSnormo 및 p-hAFS-EVShypo에서 측정되었습니다. EV는 f-hAFS 또는 p-hAFS에서 얻을 때 비슷한 수율을 보였습니다. hAFS-CM 제형의 경우 f-hAFS-EV 및 p-hAFS에서 단백질 함량 증가의 긍정적인 경향이 있습니다. EV는 저산소 자극 후 평가되었습니다. 상응하는 정상산소 조건(f-hAFS-EVSHypo∶2.03±0.67 ug/10도 세포 및 p-hAFS-EVSHypo∶1.85±0.47 ug/10도 세포, f-have-EVsnormo∶1.28±0.36ug/10도 세포 및 p -hAFS-EVsnormo∶1.19±0.31ug/10도 셀, 그림 3C).

2.4. 유사한 형태 및 크기 분포를 가진 태아 및 주산기 hAFS 출시 EV

투과전자현미경(TEM)에 의한 형태학적 분석은 f-hAFS와 p-hAFS 모두의 높은 EV-분비 증식을 높였습니다(그림 4). 우리는 정상 산소 기준선과 비교하여 저산소 사전 컨디셔닝 후 f-hAFS-EV 및 p-hAFS-EV(그림 4B)의 크기와 면적을 추가로 조사했습니다. 태아 및 주산기는 40-250 nm 범위에서 크기가 이질적인 EV를 방출하므로 엑소좀/소형 EV 및 미세소포/소포 배출이 모두 포함됩니다. 다른 그룹의 전기장당 EV의 평균 크기는 비슷했으며 태아 hAFS-EV는 90-100 nm(f-hAFS-EVsnormo:104.{16}} ±3.{18}} nm;f -have-EVSHvpo:97.10±10.10 nm) 및 주산기 측정 70-114 nm(p-hAFS-EVsnormo:94.60±19.53 nm; p-hAFS-EVShypo:76.43±4.{37}} nm, 그림 4B, 왼쪽 패널). 수율은 저산소 상태에서 자극된 hAFS가 소형 전기차량 증가에 긍정적인 경향을 보였으나, 이러한 증가는 통계적으로 유의하지 않았다. f-hAFS-EVStypo는 40-70 nm를 측정했는데 이는 정상 산소에 비해 거의 두 배였습니다. 40-70 nm,70-100 nm 및 100-130 nm를 측정한 Perinatal-has-EVSHypo는 정상산소 배양에서 얻은 양의 거의 세 배였습니다(그림 4B).

나노입자 추적 분석(NTA)은 f-hAFS-EV 및 p-hAFS-EV 제제 모두에서 증가된 수의 입자를 보여주었고 이전 분석(f-hAFS- EVsnormo:182±{7}}.1{14}}'입자/1{22}}도 셀, f-have-EVshypo: 3.30±0.22×10도 입자/10도 셀 ;p-hAFS-EVsnormo:2.43±0.80×10도 입자/10도 세포,p-hAFS-EVshypo:3.05±0.62×10도 입자/10도 세포, 그림 4C).

그림 4. 태아 및 주산기 have-EV의 형태학적 특성. (A) f-hAFS 및 p-hAFS의 투과 전자 현미경(TEM)의 대표적인 이미지(각각 상단 및 하단 왼쪽 패널, 검정색 화살표는 내부에 작은 EV/엑소좀이 있는 세포질 내 다중 소포체를 나타냄) 및 f -hAFS-EV 및 p-hAFS-EV(각각 상단 및 하단 오른쪽 패널)는 무혈청 조건 및 정상 산소 대 저산소 사전 조건(f-hAFS-EVSnormo, f-have-EVSHypoi p-hAFS-EVSnormo, 및 f-hAFS-EVshypo, 각각), 스케일 바: 200 nm. (B)왼쪽 패널: hAFS-EV 크기 분포의 TEM 분석; 오른쪽 패널: 40nm에서 250nm까지의 필드 크기 간격당 f-hAFS-EV 및 p-hAFS-EV 수의 분포가 고려되었습니다. 값은 n{27}} 독립적인 실험의 mean±sem으로 표시됩니다. (C) hAFS 크기 및 분포에 대한 나노입자 추적 분석. 왼쪽 패널: 그래픽 출력의 대표 이미지; 오른쪽 패널: 10도 분비 세포당 10도 입자로 측정된 hAFS-EVs 농도; nm: 나노미터; mL: 밀리리터.

2.5.태아 대 주산기 hAFS의 단백질 특성 분석은 재태 연령 및 저산소증 전제 조건에 따른 Secretome 구성의 차이를 강조합니다.

f-hAFS 및 p-hAFS 세크레톰 제형 둘 다의 단백질체 특성화는 나노 액체 크로마토그래피와 고분해능 질량 분석기(nLC-HRMS)의 결합을 기반으로 하는 산탄총 표지가 없는 플랫폼을 사용하여 수행되었습니다. 48개의 프로테옴 프로파일은 대조군으로서 정상 산소 조건과 비교하여 저산소 세포 사전 조건화를 겪는 f-hAFS 및 p-hAFS의 hAFS-CM 및 have-EV의 3가지 생물학적 복제물의 중복 분석에 의해 획득되었습니다. 총 4179개의 별개의 단백질 그룹이 적어도 하나의 고유한 펩티드로 확인되었으며 분자량 범위는 2~3900kDa이고 등전점은 3.6~13입니다. hAFS-EVs에서 더 높은 평균 단백질 발현이 hAFS-CM과 비교할 때 관찰되었습니다. . 얻은 모든 단백질 목록의 정렬은 확인된 단백질을 기반으로 수행되었습니다. 각 실험 조건에 대해 단백질에 기인한 펩티드 스펙트럼 일치 값(PSM)을 정규화하고 평균화하는 고유한 목록을 만들었습니다. 이 값은 각각에 할당된 질량 스펙트럼의 수를 나타내고 샘플에서 그들의 풍부함을 간접적으로 나타냅니다. hAFS-CM 및 have-EV 제형에서 확인된 단백질의 전체 목록은 표 S1에 보고되어 있습니다.

이 마스터 목록에 선형 판별 분석(LDA[51])을 적용하면 통계적으로 유의한 단백질(Fratio 4.5 이상 및** p)을 추출할 수 있습니다.<0.001)to be="" processed="" by="" hierarchical="" clustering.="" figure="" sla="" shows="" a="" clear="" separation="" and="" different="" behavior="" between="" hafs-cm="" and="" have-ev="" fractions="" generating="" two="" main="" branches,="" as="" highlighted="" by="" the="" heatmap="" color="" code.="" a="" further="" subgrouping="" was="" also="" observed="" according="" to="" the="" gestational="" age="" and="" the="" hypoxic="" preconditioning="" adopted.="" the="" fact="" that="" each="" analyzed="" condition="" presented="" a="" unique="" identity="" is="" confirmed="" by="" the="" venn="" diagrams="" (figures="" 5a="" and="" 6a,="" tables="" s1-s3)="" that="" report="" the="" distribution="" of="" proteins="" identified="" with="" a="" frequency="">hAFS-CM 및 have-EV 제형의 1은 별도로 고려됩니다. 단백질의 약 69.5%와 69.9%가 각각 hAFS-EV와 hAFS-CM 조건에서 공유된 반면, 나머지 함량은 제형 중에서 3.7%에서 13.4% 범위의 다른 비율로 배타적인 것으로 나타났습니다.

proteomic 변화를 정량적으로 조사하기 위해 집에서 만든 MAProMa 소프트웨어를 사용하고 DAve(Differential Average) 및 DCI(Differential Confidence Index)의 두 가지 알고리즘을 적용하여 레이블이 없는 차별 분석을 수행했습니다. 각각), 두 비교 용어 사이의 모든 단일 단백질의 PSM에 대해. DAve 및 DCI에 대한 엄격한 필터를 사용하여 식별 신뢰도를 최대화하고 1.5배의 배수 변화보다 큰 변이가 있는 단백질을 고려하기 위해 f-hAFS-CM 대 p-hAFS-CM 및 f-hAFS-EV 대 p-hAFS-EV는 세포 임신 단계에 따라 만들어졌습니다. 총 58개 및 109개의 단백질이 위의 has-CM 및 have-EV 구획에서 각각 다르게 발현되는 것으로 나타났습니다(선택된 세부정보의 경우 그림 S1B, C 및 확장된 형태의 표 S{17}}S3). 이 중 30개의 단백질은 f-hAFS-CM에서 상향 조절되었고 28개는 p-hAFS-CM에서 상향 조절되었습니다(그림 S1B). 마찬가지로 44개의 별개의 단백질은 f-have-EV에서 상향 조절되었고 65개는 p-hAFS-EV에서 상향 조절되었습니다(그림 S1C). 특히, f-have에서 상향 조절된 단백질은 p-ha에서 하향 조절된 것으로 간주되어야 하며 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.

값이 보고됩니다. 보고된 단백질의 전체 목록과 자세한 매개변수는 표 S2를 참조하십시오. (C) 세포 저산소 전제 조건에 따라 태아 hAFS-CM(왼쪽 패널) 및 주산기 have-CM(오른쪽 패널)에서 2 이상의 빈도로 확인된 단백질의 생물학적 과정 농축 분석. FunRich 도구를 기반으로 유전자 온톨로지 용어는 각 범주에 대해 농축된 유전자의 백분율을 보고하는 막대 차트에 표시됩니다(-have-CMnormo의 경우 분홍색 막대, f-hAFS-CMnormo의 경우 자주색 막대, p-hAFS-CMnormo의 경우 밝은 파란색 막대, 및 p-hAFS-CMhypo에 대한 파란색 공).시스탄체를 사다*p로 수정된 Bonferroni가 있는 유전자 온톨로지 용어만<0.05 are="">

이 기사는 Int에서 발췌했습니다. J. 몰. 과학. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms