PEDV의 재조합 락토바실러스 카세이 백신의 구축과 생쥐의 면역 반응
Sep 06, 2023
추상적인
배경: 돼지유행설사병(PED)은 돼지유행설사바이러스(PEDV)에 의해 발생하는 전염성 장질환으로 구토, 설사, 식욕부진, 탈수 등을 특징으로 하며 전 세계적으로 막대한 경제적 손실을 초래하고 있다. 현재 백신 면역은 여전히 PED 확산을 통제하는 가장 효과적인 방법입니다. 본 연구에서는 PEDV의 PEDVS 단백질과 Brucella abortus 균주의 OMP16 단백질을 발현하는 새로운 재조합 L. casei-OMP16-PEDVS 균주를 구축했습니다. 재조합 L. casei-OMP16-PEDVS 후보백신의 면역원성을 알아보기 위해 BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{와 비교하였다. 9}} PEDVS 및 BL{10}}PEDVS 재조합 단백질.
결과: 결과는 L. casei-OMP16-의 혈청에서 더 높은 수준의 IgG, 중화항체, IL-4, IL-10 및 INF-와 대변에서 IgA를 검출할 수 있음을 보여주었습니다. PEDVS 면역 마우스는 L. casei-OMP16-PEDVS 후보 백신이 더 높은 수준의 체액성 면역, 세포성 면역 및 점막 면역을 유도할 수 있음을 나타냅니다.
결론: 따라서 L. casei-OMP16-PEDVS는 PEDV 감염 예방을 위한 유망한 후보백신이다.
키워드: PEDV, 락토바실러스 카제이 백신, PEDV S 단백질, OMP16, 면역반응
남성의 면역체계 강화를 위한 시스탄체의 효능
소개
돼지 유행성 설사(PED)는 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)에 의해 발생하며 새끼 돼지의 설사, 구토, 식욕부진, 탈수, 체중 감소 등의 증상을 나타냅니다[1, 2]. 모든 연령의 돼지는 다양한 증상으로 감염될 수 있으며 새끼 돼지의 사망률은 최대 100%에 달하며[3] 전 세계적으로 막대한 경제적 손실을 가져왔습니다. PEDV의 확산을 통제하기 위해 수산화알루미늄 보조제 불활성화 백신, 2가 불활성화 전염성 위장염 바이러스(TGEV), PEDV 백신, 약독화 PEDV 백신 등 대부분의 종류의 백신이 만들어집니다[4]. 이러한 백신은 PED를 제어하는 데 중요한 역할을 하지만 모두 결함이 있습니다. 불활성화백신은 세포성 면역반응을 활성화시킬 수 없고, 약독화백신은 그다지 안전하지 않으며, 점막면역반응의 바이러스 특이적 IgA 항체의 충분한 생성을 유도할 수 없습니다. 따라서 PED를 제어할 수 있는 새로운 백신의 개발이 필요하고 시급하다.
락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)는 인간과 동물의 건강에 유익한 영향을 미치면서 경구 면역화에서 항원의 표적 전달을 위한 일종의 안전한 벡터 시스템으로 간주되는 경우가 많습니다[5]. 한편, T-helper 세포 반응을 조절하고 점막 면역을 위한 특정 IgA의 분비를 자극하는 전달 시스템으로 사용될 수 있습니다[6]. 반면, 락토바실러스 카제이 재조합 백신은 기존 백신에 비해 투여가 간편하고 과민반응 가능성이 낮으며 비용 효율성도 높다. 보고에 따르면 락토바실러스 카제이 재조합 백신은 인유두종바이러스, 폐렴연쇄상구균, 대장균의 예방 및 통제에 성공적으로 사용되어 왔다[7-9]. PED 백신을 설계하려는 비슷한 시도도 있습니다. 연구자들은 변종 돼지 유행성 설사 바이러스 S1 유전자를 발현하는 재조합 Lactococcus lactis 균주가 면역화된 마우스에서 높은 수준의 IL{7}} 및 IFN-을 유도할 수 있음을 발견했습니다[10]. PEDV의 COE 항원과 융합된 마이크로폴드 세포 표적화 펩타이드 Co1을 발현하는 락토바실러스 카세이 기반 항-PEDV 백신도 효과적인 면역 반응을 유도할 수 있습니다[11]. PEDV 백신의 효과를 향상시키기 위해. 본 연구에서 우리는 경구 투여를 통해 PEDV 감염에 대해 더 강력한 점막, 체액 및 세포 면역 반응을 자극할 수 있는 새로운 PED 락토바실러스 카세이 재조합 백신을 구축합니다. coronaviridae 계열의 구성원인 PEDV는 150~220kDa 글리코실화 스파이크(S) 단백질, 20~30kDa 막(M) 단백질, 7kDa 외피(E) 단백질, 58kDa를 포함하는 4가지 구조 단백질로 구성됩니다. 뉴클레오캡시드(N) 단백질[12]. 거기에서 S 단백질은 S1(1-735 아미노산)과 S2(736-마지막 아미노산) 도메인으로 나눌 수 있으며[13], S1 단백질은 수용체 결합 영역과 주요 중화 에피토프를 포함합니다. 14]. 백신 보조제는 면역조절제 역할을 하며 공동 전달된 항원에 대한 면역 반응을 유도하고 강화할 수 있습니다. Brucella abortus 균주의 OMP16 단백질은 생체 내에서 수지상 세포를 활성화하고 th1 면역 반응을 유도하는 것으로 확인되었으며 유망한 자가 보조 백신이었습니다[15-17]. 따라서 본 연구에서는 OMP16 단백질을 락토바실러스 사례 재조합 백신에 삽입하였다. 지금까지 PEDV의 Lactobacillus casei re 재조합 백신에 대한 연구는 거의 보고되지 않았습니다. 따라서 본 연구에서는 PED의 확산을 예방하기 위해 더 나은 체액성 면역, 세포성 면역, 점막 면역을 공급할 수 있는 새로운 락토바실러스 카세이 후보 경구용 백신을 구축하는 것을 목표로 한다.
한약재 시스탄체 식물-항종양
재료 및 방법
박테리아 균주, 바이러스, 배양 조건, 플라스미드 및 프라이머
시스탄체 파우더
본 연구에 사용된 박테리아 균주, 플라스미드 및 프라이머는 표 1에 나열되어 있습니다. Lactobacillus casei ATCC 393의 표준 참조 균주는 37도의 de Man Rogosa and Sharpe(MRS) 액체배지에서 배양되었습니다[18]. BL21(DE3)과 DH5는 Luria-Bertani(LB) 배지에서 37도에서 배양되었습니다[19]. 재조합 Lactobacil lus casei, BL21(DE3) 및 DH5 균주는 각각 적절한 항생제가 포함된 해당 배지에서 배양되었습니다. Brucella abortus는 Tryptic Soy Broth(TSB) 또는 Tryptic Soy Agar(TSA) 배지(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)에서 37도에서 재배되었습니다. PEDV 균주로 감염된 Vero 세포를 10 ug/mL 트립신(Gibco, Langley, VA, USA)이 보충된 DMEM(Gibco, Langley, VA, USA)에서 배양했습니다[20]. pVE5523 및 pET28a(+) 플라스미드는 각각 Lactobacillus casei 및 Escherichia coli의 발현 벡터였습니다.
표 1 본 연구에 사용된 박테리아 균주, 플라스미드 및 프라이머의 특성
재조합 락토바실러스 카세이 및 BL21 균주의 구축
재조합 발현 플라스미드는 표 1의 플라스미드와 프라이머를 기반으로 제작되었다. 먼저 PEDV S 유전자의 부분 서열(493-708 아미노산), PEDV S' 유전자의 부분 서열(493-708 아미노산), Brucella abortus OMP16 유전자(26-168 아미노산)의 부분 서열은 각각 프라이머 쌍 PEDVS-F1/R1, PEDVS-F2/R2 및 OMP16-F/R을 사용하여 증폭되었습니다. 이어서, OMP16 및 PEDVS' 단편에 중첩 확장 방법을 사용하여 중간에 링커 폴리펩티드(GGGGSGGGGGGGGGS)가 붙어 있는 새로운 단편 OMP16-PEDVS를 구성했습니다. 그런 다음, 단편 PEDVS를 EcoRI/XbaI 제한 효소를 갖는 pET28a 플라스미드에 삽입하여 재조합 플라스미드 pET28a-PEDVS를 생성하고, 새로운 단편 OMP{20}}PEDVS를 EcoRI/XbaI 및 SalI/EcoRV를 갖는 pET28a 및 pVE5523 플라스미드에 삽입했습니다. 재조합 플라스미드 pET28a-OMP16-PEDVS 및 pVE5523-OMP16-PEDVS를 각각 생성하는 제한 효소. 재조합 플라스미드(pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS 및 pVE5523-OMP16-PEDVS)는 보고된 논문[21].
Western blot을 통한 단백질 발현 분석
BL21-pET28a-PEDVS, BL21- pET28a-OMP16-PEDVS 및 L. casei-pVE5523-OMP16- PEDVS 균주의 단백질 발현은 다음과 같습니다. 일부 수정된 보고된 방법을 기반으로 검출되었습니다[21-23]. 재조합 균주 BL21-pET28a-PEDVS 및 BL21-pET28a OMP16-PEDVS를 LB 브로쓰에서 배양하고 IPTG를 사용하여 pET28a-PEDVS 및 pET28a-OMP{{22} } PEDVS 단백질. 공백 벡터는 음성 대조군으로 사용되었습니다. 세포 용해 및 원심분리 후, 상청액 및 침전물을 수집하였다. 이후 이전 연구를 바탕으로 니켈 친화성 크로마토그래피 컬럼을 이용하여 목적 단백질을 정제하였다[24]. 한편, 재조합 L. 카세이 pVE5523-OMP16-PEDVS 균주의 배양 상층액도 4도에서 10분간 9000×g로 원심분리하여 수확했습니다. 그 후, SDS(Sodium Dodecyl 황산염) 로딩 완충액을 첨가한 샘플을 10분 동안 끓였습니다. 단백질을 12% 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 분리한 후 PVDF 막(Millipore, Mississauga, ON, Canada)으로 옮겼습니다. 멤브레인 브레인을 37도에서 2시간 동안 5% 탈지유로 차단한 후 S 단백질의 쥐 단클론 항체와 함께 밤새 4도에서 배양하고 HRP 결합 염소 항-마우스 IgG(ABclonal, 중국 우한)에서 2시간 동안 배양했습니다. 37도. 단백질 밴드는 Clarity™ Western ECL Blotting Substrate(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 시각화되었습니다.
예방접종 및 샘플 수집
재조합 락토바실러스 카세이 백신의 면역원성은 Shandong Agricultural University 동물센터에서 구입한 6주령 암컷 SPF BALB/c 마우스[10, 18]를 사용하여 평가하였다. 총 50마리의 마우스를 무작위로 5개의 그룹으로 나누었으며 각 그룹에는 10마리의 마우스가 있었습니다. 마우스에 재조합 락토바실러스 카제이 백신과 정제된 단백질(pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS+Freund의 완전 보조제)을 각각 면역화했습니다. 면역 프로토콜은 표 2에 따라 수행되었으며 13일 후에 추가 면역을 실시하였다. 혈청학적 연구를 위해 꼬리 정맥 펀칭을 통해 면역화 후 0, 14, 28일(dpi)에 혈청을 수집하고 사용 전까지 -20도에 보관했습니다. 백신 접종 1일 전과 매 부스팅 시점마다 대변을 수집했습니다. IgA 검출을 위해 대변을 수집 직후 0.05M 나트륨 EDTA로 1:4 비율로 희석(w/v)하고 적절하게 혼합한 후 4도에서 14시간 동안 배양했습니다. 상등액을 12,000×g 원심분리하여 수집하고 사용할 때까지 -20도에 보관했습니다. 28dpi에서; 이전에 설명한 저자에 따라 각 그룹에서 3마리의 마우스를 희생시키고 IgA 검출을 위해 장을 처리했습니다[10, 18, 23].
항체 수준의 측정 분석
혈청 내 IgG 수준과 대변 내 IgA 수준은 일부 수정된 ELISA 방법으로 측정되었습니다[18, 23]. 방법은 다음과 같습니다. 폴리스티렌 미량역가 플레이트를 100μL 10ug/mL PEDVS 단백질, OMP{5}}PEDVS 단백질 또는 100μL 재조합 L. 카세이-OMP16-PEDVS 균주로 4도에서 밤새 코팅했습니다. . 5% 탈지유로 블로킹한 후, 수집된 샘플을 PBS에 연속적으로 희석하고, 3회 추가하여 37도에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후, HRP 결합 염소 항-마우스 IgG 또는 IgA 항체(Invitrogen, USA)를 각 웰(1:5000)에 첨가하고 37도에서 1시간 동안 배양하였다. 폴리스티렌 미세역가 플레이트는 각 단계 동안 5회 세척되었습니다. 마지막으로 TMB 기질(테트라메틸벤지딘 및 H2O2) 100μL를 각 웰에 첨가하고 10분 후에 정지 용액 50μL를 첨가했습니다. 630 nm에서의 OD 값은 다중 모드 플레이트 판독기(EnVision)를 사용하여 측정되었습니다.
바이러스 중화 분석
혈청 내 PEDV의 중화 항체 역가는 일부 변형된 방법에 따라 검사되었습니다[25, 26]. 간단히 말하면, 쥐 혈청을 열 불활성화한 다음(30분 동안 56도) 96웰 플레이트(Corning, USA)에서 각 샘플을 3배로 연속적으로 2배 희석했습니다. 그런 다음, 동일한 부피의 200TCID50/50μL PEDV 균주를 96웰 플레이트에 첨가하고 37도에서 1시간 동안 배양했습니다. 혼합물을 Vero 세포 단층으로 코팅된 새로운 96웰 플레이트에 첨가하고 37도에서 1시간 동안 배양했습니다. 그런 다음 세포를 세척하고 5% CO2, 37도 유지 배지에서 배양했습니다. 2일 후 도립현미경을 이용하여 세포변성효과(CPE)를 관찰하였고, 중성 사이징 농도는 혈청 내 항체의 최저 농도로 정의하였다.
풀 사이즈 테이블
사이토카인 검출
사이토카인의 분비를 검출하기 위해 실험용 쥐(0, 14일, 28일)로부터 상청액을 채취하였다. 분비된 IL-4, IL-10 및 IFN-의 수준은 각각 제조업체의 권장 사항에 따라 상업용 ELISA 키트(Elabscience Biotechnology Co., Ltd., 무한)를 사용하여 결정되었습니다. 사이토카인은 키트에서 제공하는 표준 시약으로 작성된 다양한 표준 곡선으로부터 정량화되었으며, 다중 모드 플레이트 리더기(EnVision)를 사용하여 각 플레이트의 450 nm에서 광학 밀도(OD) 값을 검출했습니다[23, 27].
통계 분석
모든 데이터는 최소 3번의 독립적인 실험에서 얻은 것이며 결과는 평균 ± 표준편차(SD)로 표시되었습니다. 통계 분석은 Graph Pad Prism 70 (GraphPad Software Inc., USA)에서 양측 t-검정과 일원 분석을 사용하여 수행되었습니다. 유의차는 * p < 0.05로 정의하였고, 유의차의 다양한 정도는 ** p < 0.01, * * *, p <로 지정하였다.="" 각각="">
결과
재조합 Lactobacillus casei 및 BL21 균주의 검증
제작된 재조합 플라스미드를 검증하기 위해 재조합 발현 플라스미드 pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS, pVE5523-OMP16-PEDVS를 NcoI/XhoI 제한효소를 이용하여 분해하였고, 효소 소화 결과는 도 1에 나타내었다. 전기영동도에서 표적 밴드의 크기는 예상 결과와 동일하였고, 서열분석 결과는 재조합 발현 플라스미드가 돌연변이를 나타내지 않음을 나타내었다. 이러한 결과는 pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS 및 pVE5523-OMP16-PEDVS 재조합 플라스미드의 성공적인 구성을 나타냅니다. 웨스턴 블롯 결과, 재조합 단백질 pET28a-OMP16-PEDVS 및 pET28a-PEDVS가 BL21-pET28a OMP16-PEDVS 및 BL21-의 상청액에서 발현되는 것으로 나타났습니다. pET28a-PEDVS 균주. pVE5523-OMP16-PEDVS 단백질은 L. casei-pVE5523- OMP16-PEDVS 균주의 배양 상층액에서도 확인되었습니다. 그림 2의 특정 밴드는 재조합 단백질 pET28a-OMP16- PEDVS, pVE{34}}OMP16-PEDVS 및 pET28a-PEDVS가 모두 성공적으로 수확되었음을 보여줍니다(그림 2).
그림 1. 재조합 플라스미드의 효소 소화 결과. A: pVE5523-OMP16-PEDVS 플라스미드의 효소 분해 결과입니다. M: D8000 DNA 사다리 마커; 1: pVE5523-OMP16-PEDVS 플라스미드. B: pet28a-OMP16-PEDVS 및 pET28a-PEDVS 플라스미드의 효소 분해 결과. M: D8000 DNA 사다리 마커; 1: pet28a-OMP16-PEDVS 플라스미드; 2: pET28a-PEDVS 플라스미드
후보 백신으로 면역화된 생쥐의 혈청 내 IgG 항체 수준
생성된 백신 후보의 특정 면역원성을 평가하기 위해 BALB/c 마우스를 선택하고 5개 그룹으로 나누었습니다. 그런 다음 상용 ELISA 키트를 사용하여 혈청 내 IgG와 대변 내 IgA 수준을 측정했습니다. 그 결과, 백신 접종군 간 IgG 수치에는 실질적인 차이가 없었으며, 접종 전 모든 마우스에서 IgG 항체가 거의 발견되지 않은 것으로 나타났습니다. 그러나 첫 번째 접종 이후 상당한 차이가 발견되었으며, 28일째 혈청 내 IgG 항체 수치는 14일째보다 높았습니다. 5군 마우스 중 L. casei-OMP16- PEDVS와 BL21-OMP16-PEDVS-F로 면역시킨 마우스는 유사하고 가장 높은 면역원성을 나타냈다. 따라서 L. casei-OMP16- PEDVS와 BL21-OMP16-PEDVS-F가 가장 높은 면역원성을 나타낼 수 있었고 그 다음으로 BL21-OMP16- PEDVS가 있었습니다. 및 BL21-PEDVS(그림 3).
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후보 백신으로 면역화된 생쥐의 대변 내 IgA 항체 수준
생성된 백신 후보의 특정 면역원성을 평가하기 위해, 마우스 대변 중 IgA 항체 수준도 평가했습니다. 그 결과, 예방접종 이전에는 특별한 항-PEDVS IgA 항체가 존재하지 않은 것으로 나타났습니다. 그러나 L. casei-OMP16-PEDVS 면역 마우스 BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{7}의 대변에는 다량의 IgA 항체가 존재합니다. }PEDVS 및 BL{8}}PEDVS 그룹 쥐의 면역화 후 14일. 면역화 후 28일에 L. casei-OMP16-PEDVS 면역화된 마우스의 IgA 항체 수준이 최고치에 도달했습니다. 한편, 다른 세 그룹의 IgA 항체 수준은 뚜렷한 증가를 나타내지 않았습니다. 따라서 후보 백신 L. casei OMP16-PEDVS는 BL21- OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{에 비해 면역화된 마우스에서 더 높은 수준의 항체를 자극할 수 있습니다. {18}}PEDVS 및 BL21- PEDVS 면역화된 마우스(그림 4).
그림 2. 재조합 발현 단백질의 검증. M: 단백질 마커; 1: 분비 단백질 형태 재조합 L. 카세이 pVE5523-OMP16-PEDVS 균주; 2: BL21- pET28a-OMP16-PEDVS 균주로부터 정제된 단백질; 3: BL{10}}pET28a-PEDVS 균주로부터 정제된 단백질
면역화된 생쥐의 혈청 중화 항체 수준
L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS의 후보 백신의 보호 효과를 평가합니다. , 및 BL21-PEDVS를 생쥐에서 중화 항체 수준을 측정했습니다. 결과는 예방접종 전에 중화 항체가 검출되지 않은 것으로 나타났습니다. 중화항체는 접종 후 14일째에 검출되었고, 추가 접종 후 14일째에 증가했습니다. L. casei-OMP16-PEDVS를 투여한 쥐의 항체 반응은 BL21-OMP16-PEDVS-F, BL을 경구 투여한 쥐의 항체 반응보다 더 강력한 항-PEDV 중화 활성을 나타냈습니다. 21-OMP16-PEDVS 및 BL21-PEDVS. 따라서 후보 백신 L. casei OMP16-PEDVS는 가장 높은 중화항체 수준을 자극할 수 있으며, 그 다음으로 BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP{{ 24}}PEDVS 및 BL{25}}PEDVS(그림 5).
사이토카인 수준
L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS, 및 BL21-PEDVS 면역화된 마우스, IL- 4, IL-10 및 IFN-가 각각 결정되었습니다. 그 결과, 생쥐 혈청 내 사이토카인 IL{11}}, IL-10, IFN- 수치는 모두 매우 낮았고, 예방접종 전에는 유의한 차이가 없는 것으로 나타났습니다. 반면, IL-4, IL-10, IFN- 결과에서도 유사한 변화가 관찰되었습니다. 면역화 후 14일에 L. casei-OMP16-PEDVS 면역화 마우스의 IL-4, IL-10 및 IFN- 수준이 BL21-보다 높았습니다. OMP16-PEDVS F, BL21-OMP16-PEDVS 및 BL{27}}PEDVS 면역화된 마우스. 추가 면역 14일 후 L. casei-OMP16- PEDVS 면역 마우스에서 다른 마우스에 비해 IL{29}}, IL{30}} 및 IFN- 수준이 더 높게 검출되었습니다. 세 그룹. 따라서 후보 백신 L. casei-OMP16-PEDVS는 가장 높은 IL-4, IL-10 및 IFN- 수준을 자극할 수 있으며 그 다음에는 BL21-OMP{{ 40}} PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS 및 BL{44}}PEDVS(그림 6).
그림 3. 면역화된 생쥐의 혈청에서 후보 백신의 IgG 항체 수준. 상용 ELISA 키트를 통해 면역화 전후 0일, 14일, 28일에 혈청을 수집하여 450nm의 흡광도에서 측정했습니다. 막대는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다. * p < 0.05, ** p < 0.01, **** p < 0.0001은 각각 유의차가 증가하는 정도를 나타내며, ns는 유의차가 없음을 의미합니다.
논의
2010년 10월 PEDV 변종으로 인한 PED의 대규모 발생이 발생하여 중국은 물론 전 세계적으로 막대한 경제적 손실을 가져왔습니다[1]. 그러나 기존 백신은 모두 PEDV 변종에 충분한 보호를 제공할 수 없는 CV777 고전 균주를 기반으로 설계되었습니다[4]. PEDV의 확산을 제어하고 경제적 손실을 줄이기 위해 PEDV 변종 균주의 새로운 백신도 설계되었습니다. 현재 PEDV 불활성화 백신과 PEDV 변종 균주의 약독화 백신은 모두 중국 정부의 승인을 받았으며 모두 PED 제어에 유망한 전망을 보이고 있습니다. 그러나 두 종류의 신규 백신에도 결함이 존재한다. PEDV는 소화관을 통해 돼지를 감염시키고 장 조직 친화성을 가지고 있습니다. 따라서 PEDV가 장 상피 세포로 진입하는 것을 방지하는 데에는 점막 면역이 전신 면역보다 더 효과적이며, 백신은 장관에서 효과적으로 점막 보호를 제공해야 합니다. 그래서 본 연구에서는 보다 강력한 항-PEDV 특이 IgG 및 IgA 항체를 자극할 수 있는 새로운 종류의 백신을 구축합니다. 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)는 백신 전달체로서 잠재적인 면역 조절 특성을 갖고 있으며 이 박테리아의 세포벽에 생리 활성 화합물이 발현되면 적절한 면역 반응을 자극할 수 있습니다[28, 29]. 이는 인유두종바이러스, 폐렴연쇄상구균, 대장균의 여러 이종항원을 동물모델에서 백신으로 발현하는데 널리 사용되고 있으며, 모두 우수한 면역원성을 보였다[7-9]. 불활성화 백신 및 약독화 백신과 비교하여 락토바실러스 카제이 벡터 백신은 더 높은 IgA 수준과 세포 면역 반응을 자극할 수도 있습니다. 연구에 따르면 장 내 IgA의 첫 번째 방어선은 PEDV 감염으로부터 새끼 돼지를 보호하는 데 있어서 IgG보다 더 우수할 것입니다[10, 30]. 따라서 PED의 일종의 락토바실러스 카세이 벡터 백신 개발이 유망하다. 보고에 따르면 PEDV의 S 단백질은 S1(1-735 아미노산)과 S2(736-마지막 아미노산) 도메인으로 나눌 수 있으며[13], S1 단백질은 수용체 결합 영역과 주요 중화 에피토프 [14]. 핵심 중화 에피토프(COE)는 PEDV에 대한 강력한 중화 항체를 유도할 수 있습니다[31, 32]. 항원성 분석과 결합하여 S1 유전자의 부분 서열(1477-2124 bp)을 선택하여 재조합 플라스미드를 구성했습니다. 선택된 작은 단편은 우수한 면역원성을 가질 뿐만 아니라 락토바실러스 카제이의 분비 발현에도 기여하는 것으로 입증되었습니다. 반면 Pasquevich는 Brucella abortus 외막 단백질 16이 생체 내에서 수지상 세포를 활성화하고 th1 면역 반응을 유도할 수 있으며 전신 및 경구 획득 브루셀라증에 대한 유망한 자가 보조 백신이라는 것을 발견했습니다[15]. Brucella spp.의 지질화되지 않은 외막 단백질 omp16에 대한 유사한 연구. 비강 보조제가 th1 면역 반응을 유도하고 우유 단백질에 대한 th2 알레르기 반응을 조절할 수 있다는 것도 입증되었습니다 [16]. 따라서 우리 연구에서는 면역 기능을 향상시키기 위해 재조합 플라스미드를 구성하기 위해 omp16 유전자의 부분 서열을 선택했습니다. 신규 락토바실러스 카제이 권장백신이 체액성 면역반응을 유도할 수 있는지 알아보기 위해 IgG, IgA, 중화항체 수치를 측정했습니다. L. casei-OMP16- PEDVS 재조합 백신 면역 마우스의 IgG 항체 수준은 BL21-OMP16-PEDVS-F re 재조합 백신 면역 마우스와 유의한 차이가 없었습니다. 그러나 IgA 및 중화항체 수준은 BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDV S 및 BL{47에서보다 높았습니다. }}PEDVS 재조합 백신 모방 마우스. 결과는 L. casei-OMP16-PEDVS가 더 강력한 체액성 면역 반응, 특히 IgA 항체 수준을 유도할 수 있음을 보여주었습니다. 연구에 따르면 IgA는 장의 첫 번째 방어선이며 PEDV 감염으로부터 새끼 돼지를 보호하는 데 IgG보다 더 나은 것으로 나타났습니다[30]. 또한 이번 연구에서는 L. casei-OMP16-PEDVS 재조합 백신이 PEDV에 대해 더 나은 면역학적 보호를 제공할 수 있다는 결과도 확인했습니다. 재조합 L. casei-OMP16-PEDVS에 의해 유도되는 면역반응의 유형을 알아보기 위해 IL-4, IL-10 및 IFN- 수준을 검출하여 T의 활성을 평가했습니다. 림프구. 보고에 따르면 IFN-는 병원균이 체내에 침입할 때 발생하는 세포성 면역반응에 중요한 역할을 하고, IL{60}}은 체액성 면역반응과 면역내성 및 점막면역을 촉진하는데 중요한 역할을 한다고[33], IL -10는 점막 미생물 감염에 맞서 싸우고 장 내 점막 장벽 무결성을 유지하는 데 필수적인 역할을 합니다[34]. 한편, 사이토카인 검출 결과, L. casei-OMP16-PEDVS 재조합 백신으로 면역된 마우스는 IL-4, IL-10 및 IFN-의 발현을 더욱 강하게 유도할 수 있는 것으로 나타났으며, 이는 L. casei-OMP16-PEDVS 재조합 백신이 각각 더 강력한 체액성 면역 반응, IgA 항체 수준 및 세포성 면역 반응을 유도할 수 있다는 결과를 뒷받침했습니다.
그림 5. 면역화된 생쥐의 혈청 내 후보백신의 중화항체 수준. 예방접종 전후 0일, 14일, 28일에 혈청을 채취하여 중화시험을 통해 검사하였다. 막대는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다. * p < 0.05, ** p < 0.01 및 **** p < 0.0001은 각각 유의차가 증가하는 정도를 나타내고 ns는 유의하지 않음을 의미합니다. 차이점
그림 6. 면역화된 마우스의 혈청에서 사이토카인 수준 검출. 면역화 전 또는 후 0일, 14일, 28일에 혈청을 수집하고 상업용 ELISA 키트를 통해 검사했습니다. IL-4(a), IL-10(b) 및 IFN-(c)에 대해 각각 450 nm의 흡광도에서 흡광도 값을 측정했습니다. 막대는 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다. * p < {{10}}.05, ** p < 0.01, **** p < 0.0001은 각각 유의미한 차이의 증가 정도를 나타냅니다.
결론
요약하면, L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16- PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS 및 BL{{7 }}이 연구에서는 PEDVS 후보 백신이 구축되었습니다. 한편, 마우스에서 이들 후보 백신의 체액성 면역 반응 및 세포성 면역 반응 수준을 평가하였다. 결과는 L. casei-OMP16-PEDVS로 면역된 쥐가 쥐에 비해 IgG, IgA, 중화 항체, IL-4, IL- 10 및 INF-를 더 높은 수준으로 생산할 수 있음을 보여주었습니다. BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS 및 BL21-PEDVS로 면역화된 마우스. 따라서 재조합 L. casei OMP{19}}PEDVS 후보 백신은 PEDV 감염 예방을 위한 안전하고 효과적이며 편리한 재조합 점막 백신 개발의 기반을 마련할 수 있습니다.
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