-MSH로 자극된 멜라닌 생성 억제 및 UVA 조사 각질세포에서 항산화 Nrf2 경로 활성화를 통한 엑토인의 피부 미백 효과

연락처: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 이메일:audrey.hu@wecistanche.com

You-Cheng Hseu 1,2,3,4, Xuan-Zao Chen 1, Yugandhar Vudhya Gowrisankar 1,Hung-Rong Yen 3,4,5,6, Jing-Yuan Chuang 7 및 Hsin-Ling Yang 8,*

추상적인:자외선 A(UVA)-방사선에 의한 활성산소종(ROS) 생성은 과도한멜라닌 생성피부 세포에서 색소 침착을 유발합니다. 우리는 UVA 조사 인간 (HaCaT) 각질 세포에서 천연 세균 삼투 물질인 Ectoine의 탈색 및 항 멜라닌 생성 효과를 시연하고 기본 분자 메커니즘을 설명했습니다. HaCaT 세포는 낮은 농도의 엑토인(0.5–1.5 μM)으로 전처리되었고 다양한 탈색 및 항멜라닌 생성 매개변수에 대해 분석되었습니다. 이 전처리는 UVA가 조사된 HaCaT 세포에서 ROS 생성, -MSH(-melanocyte-stimulating Hormone) 생성 및 proopiomelanocortin(POMC) 발현을 상당히 하향 조절했습니다. 또한,항산화제헴 옥시게나제-1(HO-1), NAD(P)H 탈수소효소[퀴논 1](NQO-1) 및 -글루타메이트-시스테인 리가아제 촉매 소단위(-GCLC) 단백질 발현은 녹다운이 실제로 Nrf2 경로의 중요성을 나타내는 이 효과를 손상시키는 핵 인자 적혈구계 관련 인자 2(Nrf2)의 핵 전위를 통해 매개됩니다. 엑토인은 p38, 단백질 키나제 B(AKT라고도 함), 단백질 키나제 C(PKC) 및 카제인 키나제 II 단백질 키나제(CKII) 경로를 통해 Nrf2의 활성화를 매개하고 있었습니다. Ectoine 전처리 및 UVA 조사 HaCaT 세포에서 얻은 조건 배지티로시나제, tyrosinase-related protein-1 및 -2(TRP-1/-2), cyclic AMP(c-AMP) protein kinase, c-AMPresponse element-binding protein(CREB) ) 및 멜라닌 합성을 억제하는 흑색종 B16F1{18}} 세포로 이어지는 소안구증 관련 전사 인자(MITF) 발현. 흥미롭게도, -MSH로 자극된 B16F10 세포에서 이러한 항멜라닌 생성 효과는 50–400 μM 농도의 엑토인에서만 관찰되었으며, 이는 엑토인(0.5–1 μM) 처리된 케라티노사이트가 피부에서 중요한 역할을 함을 나타냅니다.희게 함효과. 우리는 Ectoine이 탈색 및 항멜라닌 생성 효능을 가진 효과적인 국소 천연화장품으로 사용될 수 있다고 결론지었습니다.

키워드:엑토인; 각질세포;멜라닌 생성; 티로시나제; -MSH; Nrf2

Cistanche는 항산화 효과가 있습니다.

1. 소개

인간의 피부를 UVA 방사선에 노출시키면 ROS 생성과 피부 세포의 멜라닌 색소 과잉 생성이 유발됩니다. ROS의 통제되지 않은 생산은 흑색종 상태로 이어질 수도 있습니다. 대부분의 피부 미백제는 표적으로 삼고 최소화하기 위해 노력하고 있습니다.멜라닌 생성-MSH의 억제를 통한 과정과티로시나제프로덕션 [1]. 대부분의 피부톤 미백 크림은 히드로퀴논[2] 또는 히드로코르티손[3]으로 구성되며, 이는 멜라닌 생성을 감소시키는 것으로 알려져 있으며 심각한 부작용과도 관련이 있습니다. 예를 들어, 여드름, 벗겨지고 가려운 피부, 피부의 청색 및 흑색 변색, 오크로노시스, 작열감 및 따끔 거림 피부 자극, 심지어 염증. 그러나 피부희게 함예를 들어, Kojic acid(Penicillium 및 Aspergillus 종에서 얻은 진균 유도체)와 같은 천연 소스의 약제도 민감한 피부를 가진 개인에게 '접촉 피부염'을 유발하는 것으로 보고되었습니다. 이러한 개인에서 1% 이상의 코직산은 심각한 과민성 부작용을 일으킬 수 있습니다[4,5]. 따라서 소수의 천연 유래 피부만이희게 함현재 화장품 산업에서는 올레오신, 감초 추출물, 아스코르브산, 대두 단백질, N-아세틸 글루코사민 등의 제품이 사용되고 있다[6]. 그러나 주로 탈색소성을 목표로 하는 스킨케어 제품은 때때로 UVA 조사로 인한 ROS 생성 매개 과잉으로 인한 유해한 영향을 상쇄하는 데 초점을 맞추지 못했습니다.멜라닌 생성피부 세포에서.

엑토인은 스트레스를 받는 여러 종의 미생물에서 생산되는 '천연 극단액'입니다[7,8]. 이 화합물은 이집트 사막에 서식하는 박테리아의 Ectothiorhodospira 종에서 처음으로 분리되었습니다. ect 오페론 유전자(ectA, ectB, ectC 또는 ectD)의 캐스케이드가 이 화합물의 생산에 관여합니다. 엑토인은 화학적으로 1,4,5,6-테트라하이드로-2-메틸{7}}피리미딘카르복실산으로 지정됩니다[9]. 수분 결합제로서 엑토인은 피부 세포막의 구조화[10], UV 손상 및 공해로부터의 보호[11,12], 피부 보습[13], 조기 피부 노화 지연[14] 등을 도와줍니다. 피부 보호 역할에 엑토인은 아토피성 피부염[15], 알츠하이머[16], HIV 복제 억제[17], 방사선 및 화학요법[18], 간경화[18] 치료에 유용한 것으로 나타났습니다. 19]. 엑토인은 바람직하지 않은 부작용을 일으키지 않으면서 탈색소화 및 피부 미백 특성을 나타내는 것으로 추측됩니다[20]. 대조적으로, Ectoine에 의해 유발된 분자 메커니즘은 알려져 있지 않습니다. 따라서, 이 연구의 목적은 세포 모델 시스템으로서 UVA 조사 인간(HaCaT) 각질세포에서 유도된 엑토인 매개 탈색소 및 항멜라닌 생성 기전을 기술하는 것이었다. 엑토인에 의해 유도된 HaCaT 세포로부터의 피부보호제 분비가 배양액(컨디셔닝된 배지)에 미치는 영향도 전형적인 흑색종 세포(B16F10)주를 이용하여 시험하였다.

2. 재료 및 방법

2.1. 시약 및 항체

Ectoine(제품 번호: 81619, 순도 95% 이상)은 Sigma-Aldrich(Taufkichen, Germany)에서 구입했습니다. 태아 소 혈청(FBS), 페니실린/스트렙토마이신, 둘베코 변형 독수리 배지(DMEM) 및 l-글루타민은 Invitrogen/Gibco BRL(Carlsbad, CA, USA)에서 구입했습니다. l-DOPA, 멜라닌, 3-4,5-디메틸-2-일{8}},5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드(MTT) 및 -MSH는 Sigma Chemical Co에서 조달했습니다. (미국 미주리주 세인트루이스). N-아세틸시스테인(NAC) 및 20,{13}디클로로플루오레세인-디아세테이트(DCFH{15}}DA)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 조달했습니다. JNK(SP600125), ERK1/2(PD98059), p38(SB203580), PKC(GF109203X) 및 CKII에 필요한 모든 약리학적 억제제는 Calbiochem(La Jolla, CA, USA)에서 구입했습니다. PI3K/AKT 억제제(LY294002)를 구입했습니다. Sigma-Aldrich(미국 미주리주 세인트루이스). POMC, CREB, -액틴에 대한 모든 항체,티로시나제, Nrf2, p-CREB, NQO-1, PKC, Kelch-유사 ECH 관련 단백질-1(Keap-1) 및 TRP-1, TRP-2 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Heidelberg, Germany)로부터 입수하였다. -GCLC 및 HO{10}}에 대한 항체는 Gene Tex Inc.(미국 텍사스주 샌안토니오)에서 조달했습니다. 우리는 Abcam(Cambridge, MA, USA)에서 c-AMP protein kinase와 CKII에 대한 항체를 얻었다. Histones, MITF, p-p38, p38, p-AKT 및 AKT는 Cell Signal Technology(Beverly, MA, USA)에서 입수했습니다. ECL(Enhanced chemiluminescence) 검출 시약은 Millipore(Billerica, MA, USA)에서 구입했습니다. 다른 모든 시약(HPLC 등급)은 Sigma-Aldrich 또는 Merck & Co., Inc.에서 구입했습니다. (독일 다름슈타트).

2.2. 세포 배양

우리는 Cell Line Services(CLS, Eppelheim, Germany)와 American Type Culture Collection(ATCC, VA, USA)에서 불멸화된 인간 피부 각질세포 HaCaT 및 쥐 흑색종 B16F10 세포를 얻었다. 세포는 37℃에서 5% CO2가 보충된 가습 인큐베이터에서 10% 열 활성화 FBS, 1% 스트렙토마이신/페니실린 및 2mM L-글루타민이 보충된 DMEM에서 배양되었습니다.

2.3. 세포 처리 및 UVA 조사

UVA 조사 전에 세포를 Ectoine(0.5–1.5 µM for 24 h) 또는 비히클(PBS)로 전처리했습니다. 배양 후 PBS로 세척한 세포를 UV CROSS-LINKER CL-508(UVItec, Cambridge, 영국) [21].

2.4. 세포내 ROS 분석

HaCaT 세포를 10% FBS로 보충된 DMEM이 포함된 8-well Lab Teck 챔버에 1.5 × 105밀도로 시딩하고 80% 합류로 성장했습니다. 이 세포를 먼저 1.5μM 엑토인으로 처리한 다음 규정된 시간 동안 3J/cm2 UVA 조사에 노출시켰습니다. 세포를 PBS로 세척하고 DCFH{10}}DA 방법을 사용하여 세포 내 ROS 생산을 결정했습니다. 각 조건에 대해 Olympus Software 솔루션 소프트웨어를 사용합니다[21].

2.5. 멜라닌 정량

6-웰 플레이트에서 쥐 흑색종 B16F10 세포를 2.5 × 105cells/well의 밀도로 시딩했습니다. 100, 200, 400 µM의 엑토인으로 2시간 동안 -MSH의 부재 또는 존재 하에 전처리했습니다. (1 μM). 멜라닌의 정량화에 사용된 프로토콜은 이전에 설명된 방법을 따랐습니다[21]. 우리는 470 nm의 흡광도 파장을 가진 ELISA 마이크로플레이트 리더로 멜라닌 함량을 측정했습니다.

cistanche는 멜라닌을 억제합니다.

2.7. 웨스턴 블롯

HaCaT(1 × 1{9}}6세포/10cm 접시) 또는 B16F10(1 × 106세포/10cm 접시) 세포를 다양한 농도의 엑토인(0.5, 1, 1.5μM) 또는 -MSH(1 μM)에 이어 UVA의 부재 또는 존재하에 규정된 시간 동안 조사. PBS 세척된 세포를 수확하고, 처리 후 단백질 함량(핵 및 세포질)을 분리하였다. 그런 다음 세포는 다양한 핵 및 세포질 단백질의 발현을 결정하기 위해 이전에 사용된 Western blot 방법에 적용되었습니다[21].

2.8. RNA 추출 및 RT-PCR

엑토인 전처리된(1.5 μM, 24시간) HaCaT 세포에 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad)을 적용하여 이들 세포로부터 전체 RNA를 분리했습니다. Bio-Rad iCycler PCR 기기(Bio-Rad, Hercules, CA, 미국). 사용된 Nrf2의 정방향 및 역방향 프라이머는 F: 50-AAACCAGTGGATCTGCCAAC{12}},R{13}}GCAATGAAGACTGGGCTCTC{14}}입니다. 사용된 GAPDH용 정방향 및 역방향 프라이머는 F: 50-GCATCCTGGGCTACACTGA-30, R: 50-CCACCACCCTGTTGCTGTA{18}}입니다. 실험이 끝나면 1% 아가로스 젤을 사용하여 PCR 산물을 분석했습니다. 그런 다음 ethidiumbromide 염색으로 가시화하였다. 내부 대조군으로 GAPDH를 사용하였다[22].

2.9. 면역형광 분석

HaCaT 세포는 {{3}well Lab Tek 챔버(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 10% FBS가 포함된 DMEM 보충제에서 1 × 104cells/well의 밀도로 배양되었습니다. 우리는 표시된 시간 동안 1.5 μM Ectoine으로 세포를 전처리한 다음 UVA가 없거나 없는 상태에서 조사했습니다. 세포는 이전에 기술된 방법을 사용하는 면역형광 분석을 받았다[21].

2.10. 통계 분석

이 연구에 사용된 모든 결과에 대해 평균 ± 표준 편차(평균 ± SD)를 사용했습니다. 모든 데이터는 분산 분석(ANOVA)으로 분석한 후 쌍별 비교에 대한 Dunnett의 검정을 수행하여 3의 평균 ± SD로 표시했습니다. 또는 더 많은 독립적인 실험. 통계적 유의성은 * p < 0로="" 설정되었습니다.05;="" **="" p="">< 0.01;="" ***="" p="">< 0.{11}}01="" 처리되지="" 않은="" 대조군="" 세포와="" 비교할="" 때,="" 그리고="" #="" p="">< 0.05;="" ##="" p="">< 0.01;="" uva에="" 노출된="" hacat="" 세포="" 또는="" -msh="" 처리된="" b16f10="" 세포와="" 비교할="" 때="" ###="" p=""><>

3. 결과

3.1. HaCaT 세포에서 엑토인 억제 UVA 유도 ROS 생성

먼저, 우리는 UVA 조사된 HaCaT 세포에 대한 엑토인(그림 1A)의 세포독성 효과를 테스트했습니다. 우리의 MTT 데이터는 처리되지 않은 대조군 세포와 비교할 때 엑토인 전처리(0.5–1.5 μM)를 나타냅니다. 및 3 J/cm2 UVA에 노출된 HaCaT 세포는 세포 생존율에서 상당한 감소를 나타낼 수 없었습니다(그림 1B). 또한, Ectoine 전처리는 UVA(3J/cm2)에 의해 유도된 세포 사멸을 용량 의존적 방식으로 약화시켰다(그림 1B). 대조군 세포와 비교할 때 3J/cm2 UVA 조사 및 엑토인 단독 처리(1.5μM)가 ROS 수준을 5- 및 2-배 크게 상향 조절했음을 나타내는 형광 데이터 외에도, 각기. 그러나 Ectoine 전처리의 경우 ROS 수준이 크게 하향 조절되었으며 Ectoine이항산화제UVA 조사에 대한 효과. 이것은 또한 HaCaT 세포에서 ROS의 기초 수준을 유도합니다(그림 1C, D).

3.2. UVA 조사 HaCaT 세포에서 엑토인 억제 POMC 및 -MSH 발현

UVA에 노출된 각질세포는 ROS-p53 매개 POMC와 POMC에서 파생된 smallpeptide 호르몬 -MSH에 대해 자극을 받았습니다[23]. 따라서 우리는 Ectoine 전처리 HaCaT 세포에서 -MSH, POMC 및 기타 관련 단백질의 발현 변화 패턴을 결정한 다음 UVA(3 J/cm2)에 노출시켰다. Western blot 데이터는 UVA로 유도된 -MSH 및 POMC 발현의 상향 조절이 엑토인 전처리에 의해 하향 조절되었음을 나타냅니다. 반면, UVA 조사 없이 엑토인 처리는 조사되지 않은 HaCaT 세포의 -MSH 및 POMC 발현을 완전히 억제했습니다(그림 2A). 나중에, 우리는 Ectoine 전처리 및 UVA 조사 HaCaT 세포에서 얻은 '컨디셔닝된 배지'(10mL/100mm 플레이트)의 효과를 테스트했습니다.멜라닌 생성B16F10 흑색종 세포. 그림 2B는 이 조절된 배지가 하향조절되었음을 보여줍니다.티로시나제, TRP-1, TRP-2, c-AMP 단백질 키나제, p-CREB, CREB 및 B16F10 세포의 MITF 수준.

3.3. -MSH-자극된 B16F10 세포에서 엑토인 하향조절된 멜라닌 및 티로시나제 발현

B16F10 흑색종 세포에 먼저 더 높은 농도의 엑토인을 적용하고 MTT 분석을 사용하여 세포독성 효과를 측정했습니다. 그림 3A는 엑토인이 더 높은 농도(72시간 동안 100-400μM)에서 B16F10 세포의 생존력에 큰 영향을 미치지 않았음을 보여줍니다. 그러나 세포 생존율은 엑토인 처리 24시간 및 48시간에 영향을 미치지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음). 따라서 이러한 농도를 사용하여 -MSH 자극에 대한 엑토인의 효과를 결정했습니다.멜라닌 생성B16F10 세포에서. 멜라닌 정량 데이터는 대조군 세포와 비교하여 -MSH(1μM) 단독 처리가 멜라닌 수준을 25% 이상 크게 상향 조절함을 보여주었습니다. 그러나 -MSH 단독 처리와 비교하여 증가하는 농도의 엑토인(72시간에서 100-400μM)에 노출된 세포는 최대 85%(또는 처리되지 않은 경우보다 -15%)의 최대 하향 조절로 멜라닌 함량의 백분율을 용량 의존적으로 상당히 하향 조절했습니다. 대조군)은 400 μM의 엑토인 전처리에서 관찰되었습니다(그림 3B). 더욱이, 우리의 웨스턴 블롯 데이터는 또한 -MSH가 자극되었음을 보여주었습니다.티로시나제(24시간) 및 p-CREB(2시간) 발현은 이러한 흑색종 세포에서 엑토인 전처리 농도가 증가함에 따라 유의하게 하향조절되었습니다(그림 3C).

3.4. 엑토인은 HaCaT 세포에서 HO-1, NQO-1 및 -GCLC 단백질의 발현을 상향 조절했습니다

Nrf2의 엑토인 매개 핵 전위 및 HO-1, NQO-1 및 -GCLC 단백질의 후속 다운스트림 발현에 대한 시간의 영향을 결정하기 위해 HaCaT 세포를 1.5 μM 엑토인에 노출시키고 세포 단백질을 수확했습니다. 0.5, 1, 2, 4, 8 또는 12시간 후 엑토인 치료. Western blot 데이터는 -GCLC 단백질을 제외하고 1.5μM Ectoine이 4시간 시점에서 HO{16}}, Nrf2 및 NQO{18}} 단백질의 최대 발현을 유발함을 나타냅니다. -GCLC는 8시간 시점에 표시되었습니다(그림 5A). 시간 곡선에서 얻은 데이터는 엑토인 농도가항산화제4h 시점에서 단백질. 그림 5B는 3가지 항산화 단백질이 모두 1.5μM의 Ectoine 농도에서 최대 발현을 나타냄을 보여줍니다. 나중에 UVA 조사 HaCaT 세포에서 Nrf2 및 Keap{6}} 비율의 발현에 대한 Ectoine 전처리 효과를 테스트했습니다. 서양 데이터 분석에 따르면 1.5µM의 엑토인으로 전처리한 결과 UVA 조사 HaCaT 세포에서 Nrf2/Keap{12}} 비율이 증가했습니다(그림 5C). 또한 NQO의 발현 증가와 일관된 데이터를 보았습니다. 3 J/cm2 UVA로 조사된 엑토인 사전 처리된 HaCaT 세포의 -1, H2O{16}} 및 -GCLC 단백질(그림 5D). 이 데이터는 엑토인 전처리가 UVA 조사된 HaCaT 세포에서 보호 역할을 한다고 추론합니다.

3.5. 다양한 신호 전달 경로가 엑토인 처리된 HaCaT 세포에서 Nrf2의 활성화에 관여했습니다

우리는 Nrf2의 엑토인 매개 핵 전위에 관련된 신호 전달 경로를 결정했습니다. HaCaT 세포를 PI3K/AKT, ERK, p38, JNK, PKC, ROS 및 CKII 신호 전달 경로의 약리학적 억제제로 사전 처리한 후 1.5μM 엑토인을 처리했습니다. 핵 Nrf2의 웨스턴 블롯 데이터는 p38 MAPK, PI3K/AKT, PKC 및 CKII 경로가 이 메커니즘에 관여한다는 것을 보여주었습니다(그림 6A). 얻은 정보에서 우리는 또한 항산화 단백질의 발현에서 이러한 경로가 수행하는 역할에 대한 엑토인 전처리의 효과를 결정했습니다. 그림 6B는 MAPK, p38, PI3K/AKT, CKII 및 PKC 경로의 약리학적 억제가 NQO{16}}, HO{17}} 및 -GCLC의 발현을 하향 조절함을 보여줍니다.항산화제HaCaT 세포의 단백질. 또한, Ectoine에 노출된 상태에서 AKT, p38의 인산화 및 PKC와 CKII의 발현에 걸리는 시간은 p-AKT를 제외하고 p38의 인산화와 PKC와 CKII의 발현이 늦게 일어남을 나타낸다. 시점만(30분 후)(그림 6C). AKT의 경우 인산화가 30분에 피크에 도달한 15분 시점부터 관찰되었습니다(그림 6C). AKT의 경우 인산화가 30분에 정점에 도달한 15분 시점부터 관찰되었습니다(그림 6C). 이러한 누적 결과는 p38, AKT, PKC 및 CKII 신호 전달 경로가 항산화제 엑토인 매개 핵 전위를 활성화함을 시사했습니다. Nrf2는 항산화 단백질의 발현을 유도합니다.

3.6. Nrf2의 녹다운으로 인해 엑토인 매개 항 멜라닌 생성 효과가 억제되었습니다.

엑토인 매개 항염증에서 Nrf2의 역할멜라닌 생성HaCaT 세포에서 Nrf2를 억제함으로써 결정되었습니다. 웨스턴 블롯의 데이터에 따르면 1.5μM 엑토인에 노출된 Nrf2 녹다운 세포가 NQO-1, HO{5}} 및 -GCLC의 최소 발현을 나타냈습니다.항산화제단백질(그림 7A). 나중에, 우리는 UVA 조사(3 J/cm2) HaCaT 세포에서 -MSH 수준의 발현에 대한 Nrf2 녹다운의 효과를 테스트했습니다. 웨스턴 블롯 결과는 siRNA 형질감염된 세포를 제어하기 위해 UVA 조사가 엑토인에 노출되지 않은 세포에서 -MSH 수준의 발현의 상향 조절에서 유의하다는 것을 나타내었다(도 7B). 그러나 1.5μM Ectoine은 이 효과를 억제했습니다. 다른 경우에, siNrf2로 형질감염된 세포는 처리되지 않은 세포 및 처리된 세포 모두에서 -MSH 수준의 발현 감소를 나타냈다(도 7B). -MSH 데이터와 유사하게, 우리의 형광 데이터는 UVA 조사가 엑토인 처리되지 않은 대조군 siRNA 세포에서 ROS 생산을 유의하게 상향조절함을 나타내었습니다(그림 7C, D). 그러나 이 효과는 세포가 1.5 μM 엑토인에 노출되었을 때 크게 억제되었습니다. 한편, Nrf2 형질전환 세포와 UVA를 조사한 HaCaT 세포는 UVA를 조사하지 않고 엑토인 처리에 노출시킨 Nrf2 형질전환 세포에 비해 ROS 수준이 대략 8-배 증가하는 것으로 나타났습니다(그림 7C, D). 이 모든 데이터는 UVA로 조사된 HaCaT 세포에서 멜라닌 생성을 최소화하는 Nrf2가 수행하는 엑토인 매개 보호 역할을 나타냅니다. . 이 모든 데이터는 UVA 조사 HaCaT 세포에서 멜라닌 생성을 최소화하는 Nrf2가 수행하는 엑토인 매개 보호 역할을 나타냅니다.

cistanche 효능: 피부 미백

4. 토론

다양한 피부-희게 함에이전트는 화장품 산업에서 사용됩니다. 이러한 약제의 대부분은 화학적 기원이며 암을 비롯한 다양한 부작용을 유발하는 한계를 가지고 있습니다[24-26]. 따라서 안전하고 천연적인 피부 미백제의 식별은 시대의 필요성을 나타냅니다. 엑토인(그림 1A)은 페이스 크림 및 기타 화장품의 활성 성분으로 사용되는 것으로 알려져 있습니다. 이는 피부 보습제 역할을 하며 조기 피부 노화도 지연시키는 것으로 간주됩니다[27]. 거의 모든 알려진 피부 미백제는 피부의 하향 조절을 목표로 합니다.티로시나제감소시키는 UV 조사된 세포에서 효소 활성멜라닌 생성피부 세포에서. Yao et al. 시연희게 함생합성된 Ectoine의 특성을 확인하고 그것이 미백제임을 시사했습니다. 그들의 연구에서 그들은 마우스 흑색종(B16F0) 및 인간 흑색종(A2058) 세포주에 대한 미백 효과에 대해 고농도(500 µM)의 엑토인을 테스트하고 엑토인이 안전하고 화장품 및 임상 적용을 위한 잠재적 제제[20]. 그러나 이 연구에서 우리는 UVA 조사 HaCaT 세포에 대한 낮은 농도의 엑토인(0.5–1.5 μM)의 유익한 효과를 추가로 테스트했으며 기본 분자 메커니즘이 해독되었습니다. 우리 연구에서 Ectoine은 Nrf2/ARE 경로를 통해 항산화 유전자 발현을 유도할 뿐만 아니라 POMC의 억제를 통해 UVA 조사 HaCaT 세포에서 -MSH 수준을 하향 조절하는 것으로 나타났습니다. -MSH 수준의 감소는 멜라닌 생성 감소로 이어지는 티로시나제 효소 활성의 하향 조절과 상관관계가 있었습니다. 우리가 아는 한, 이것은 UVA 조사 HaCaT 세포에서 Ectoine에 의해 유발된 메커니즘에 의해 입증된 첫 번째 보고서입니다. 이 연구는 HaCaT 세포에서 Ectoine이 세포 모델 시스템으로 나타내는 분자 메커니즘을 설명했습니다.

우리는 먼저 HaCaT 세포의 생존 가능성에 대한 UVA 방사선의 영향뿐만 아니라 엑토인의 준치사 농도를 결정했습니다. 우리의 MTT 데이터는 낮은 농도의 엑토인(0.5–1.5 µM)이 HaCaT 세포의 생존력에 큰 영향을 미치지 않았음을 나타냅니다(그림 1B). 엑토인 전처리는 3 J/cm2 UVA 조사 HaCaT 세포의 생존력을 증가시켰습니다(그림 1B). 이러한 관찰을 바탕으로 우리는 1.5μM의 엑토인 전처리와 3J/cm2의 UVA 조사를 사용하여 추가 실험을 계속했습니다.

피부 각질세포에서 UVA 조사에 의한 ROS 생성은 잘 알려진 사실이다[28]. 따라서 HaCaT 세포에서 UVA-방사선 유도 ROS 생성에서 엑토인 전처리의 유익한 효과에 대해서도 테스트했습니다. 우리의 DCF 형광 강도 데이터는 1.5 μM의 Ectoine을 사용한 전처리가 UVA 방사선 유도 ROS 생성 inkeratinocytes를 크게 하향 조절했음을 나타냅니다. 또한 1.5 μM의 엑토인이 통계적으로 유의한 것으로 나타난 HaCaT 세포의 ROS 수준의 기초 수준 증가를 유발할 수 있음을 관찰할 수 있었습니다(그림 1D, E).

Rousseau et al. POMC는 인간 표피 각질세포와 멜라닌 세포에서 분비되며멜라닌 생성[29]. 이를 고려하여 HaCaT 세포의 멜라닌 생성 관련 단백질에 대한 UVA 조사 및 Ectoine 전처리 효과도 테스트했습니다. 우리의 웨스턴 블롯 데이터는 UVA 조사된 HaCaT 세포에서 -MSH 및 POMC 단백질 발현의 용량 의존적 하향조절이 엑토인에 의한 전처리에 의해 야기되었음을 나타냈다. 반대로 엑토인 전처리는 의 발현 패턴에 차등적 영향을 미친다.멜라닌 생성- 관련 단백질. 특히, 거의 모든 테스트된 단백질(티로시나제, TRP-1, TRP-2, c-AMP proteinkinase, CREB 및 MITF)는 UVA 조사 HaCaT 세포에서 엑토인 전처리 농도가 증가함에 따라 발현이 감소하는 것으로 나타났습니다(그림 2A, B). 이 데이터는 엑토인이 UVA 조사된 HaCaT 세포에서 항멜라닌 생성 특성을 보유한다는 사실을 나타냅니다.

Ectoine의 항멜라닌 생성 효능은 B16F10 세포에서 추가로 테스트되었습니다.멜라닌 생성연구[30]. 우리 연구에서 주목할만한 관찰 중 하나는 HaCaT 세포와 달리 -MSH로 자극된 B16F10 세포에서 멜라닌 합성을 억제하기 위해 고농도의 엑토인(100-400 μM)이 필요하다는 것입니다(그림 3B). 우리의 Western blotdata는 Ectoine이 용량 의존적으로티로시나제및 -MSH-자극된 B16F10 세포의 p-CREB단백질은 상기 효과를 유도한다(도 3C). 따라서 이러한 고농도의 엑토인이 B16F10 세포의 생존력에 영향을 미칠 수 있는지 여부도 테스트했습니다. 우리의 MTT 결과는 고농도의 엑토인(100-400 μM)이 B16F10 세포의 생존력에 영향을 미치지 않았음을 나타냅니다(그림 3A). 이러한 결과는 각질세포가 엑토인 매개항체에 중요한 역할을 한다는 것을 의미합니다.멜라닌 생성및 탈색 효과.

피부 세포 대사에서 전사 인자 Nrf2의 역할은 잘 문서화되어 있습니다[31]. 따라서 우리는 각질세포에서 엑토인 매개 효과에서 Nrf2/Keap{3}} 경로가 수행하는 메커니즘을 추가로 테스트했습니다. 그림 4A는 1.5μM 엑토인 농도에서 최대 효과를 나타내는 Nrf2/Keap{7}} 비율을 용량 의존적으로 크게 증가시킨 엑토인이 관찰되었음을 보여줍니다. 또한 1.5 μM 엑토인이 2시간 시점에서 관찰된 핵 단백질 분획에서 Nrf2의 최대 발현으로 Nrf2 단백질의 핵 전위를 선호하는 것으로 관찰되었습니다(그림 4B). HaCaT 세포의 면역형광 염색에서 얻은 데이터도 이 효과를 뒷받침했습니다 (그림 4D).

인간 멜라닌 세포와 각질 세포에서 Marrot et al. 그리고 다른 사람들은 광산화 스트레스 반응에서 Nrf2 방어 경로의 중요성을 설명했습니다[32]. 우리도 HaCaT 세포에서 엑토인 매개 항산화 단백질 발현의 효과를 연구했습니다. 우리의 시간 곡선 데이터는 세 가지 항산화 단백질(HO-1, NQO{5}}, -GCLC) 및 Nrf2 모두의 엑토인 매개 발현이 시간이 증가함에 따라 이상 방식으로 발현되는 것으로 나타났습니다({{ 8}}.5–12 h) 관찰 가능한 효과가 4시간 시점에서 기록되었습니다(그림 5A). 이로부터 엑토인 농도의 영향을 측정하는 농도 곡선항산화제단백질 발현은 또한 4시간 시점에서 결정되었다. 그림 5B는 처리되지 않은 세포와 비교하여 Ectoine 처리가 HO-1, NQO-1, -GCLC 단백질의 발현을 용량 의존적으로 증가시켰음을 보여줍니다. 우리는 또한 엑토인 농도가 UVA 방사선에 노출된 HaCaT 세포에서 보호 효과를 나타내는 방법을 측정했습니다. Western blot 데이터는 Ectoine이 Nrf2/Keap{9}} 비율의 극적인 상향 조절과 함께 항산화 단백질의 발현을 용량 의존적으로 증가시키는 것으로 나타났습니다(그림 5C, D). 이러한 결과는 엑토인 전처리(1.5μM, 4시간)가 UVA 노출에 의해 제기된 유해한 영향을 상쇄할 수 있는 HaCaT 세포에서 항산화 단백질 발현을 유도하는 잠재적인 효과가 있음을 나타냅니다.

산화 방지제

5. 결론

위의 데이터에서 우리는 낮은 농도의 엑토인(0.5–1.5 µM)이 POMC의 억제를 통해 -MSH와 멜라닌 생성을 하향 조절할 수 있다고 결론지었습니다.티로시나제UVA가 조사된 HaCaT 세포의 경로에서멜라닌 생성효능. 또한, Ectoine은 HaCaT 세포에서 세포 내 ROS 생성 억제에도 관여했습니다. HaCaT 세포와 달리 고농도의 엑토인(50–400 μM)은 B16F10 흑색종 세포에서 유사한 효과를 나타낼 수 있었으며, 이는 각질세포가 엑토인 매개 항염증에 중요한 역할을 할 수 있다는 사실을 의미합니다.멜라닌 생성그리고 피부-희게 함피부 세포에 미치는 영향. 가장 중요한 것은 Nrf2 경로의 활성화를 통한 Ectoine 매개유익한 효과로,항산화제단백질 HO-1, NQO-1 및 -GCLC. AKT는 다른 경로(p38, PKC 및 CKII)가 뒤따르는 Nrf2의 활성화를 시작하는 첫 번째 신호 전달 경로인 것으로 나타났습니다. 마지막으로, Nrf2의 침묵은 Nrf2가 -MSH 생산뿐만 아니라 세포 내 ROS의 조절에 중요한 역할을 한다는 증거를 직접적으로 제공했습니다. 우리는 엑토인의 주요 미백 메커니즘이 UVA 조사 HaCaT 세포에서 ROS-p53/POMC{10}MSH 경로의 억제에 의해 추론되어야 한다고 결론지었습니다. 따라서 엑토인 또는 그 유도체는 보습제 및 로션의 활성 성분일 수 있습니다 잠재 및 천연 기반 피부로 사용되는희게 함화장품 업계의 에이전트.

항산화 시스탄체 보충제